فصلنامه زیست شناسی میکروارگانیسم ها
پیاپی 11 (پاییز 1393)

امروزه استفاده بیش از حد از تلوریت، محیط را متحمل اثرات سمی ناشی از این اکسی آنیون کرده است. از این رو تیمار زیستی مناطق آلوده، به عنوان روشی ارزان و سازگار با محیط زیست، مطرح است. اگرچه اثرات سمی تلوریت برای بیشتر میکروارگانیسم ها گزارش شده ولی گونه های مختلفی از باکتری ها، از جمله باکتری نمک دوست مورد استفاده در این پروژه می تواند بر سمیت آن با احیای این اکسی آنیون به شکل عنصریش غلبه کند. هدف این مطالعه، شناسایی مسیر آنزیمی به سم زدایی تلوریت بود. در ابتدا به منظور بالا بردن فعالیت آنزیمی و از دست ندادن آن طی فرآیند خالص سازی، بهینه سازی آزمون مناسب برای بررسی فعالیت آنزیمی و شرایط تولید آن انجام شد. بهینه سازی با «روش یک عامل در هر زمان» انجام شد. عامل های مختلفی از جمله: زمان، درصدهای مختلف مایه تلقیح، اسیدیته، غلظت های مختلف تلوریت و نمک های مختلف بهینه شد. به منظور اطمینان در طی پژوهش میزان حذف تلوریت نیز بررسی شد. خالص سازی آنزیم مورد نظر با روش های مختلف مانند، رسوب با آمونیوم سولفات و کروماتوگرافی ستونی میان کنش هیدروفوب با غلظت 4/1 مولار اشباع آمونیوم سولفات انجام شد. خلوص آنزیم در طی هر مرحله باSDS-PAGE بررسی شد.
شرایط بهینه به دست آمده نشان داد که در زمان 30 ساعت، 3 درصد مایه تلقیح، اسیدیته 7/5، بدون حضور تلوریت و در 5 درصد نمک NaCl، بالاترین میزان فعالیت آنزیم و حذف تلوریت مشاهده می شود. خالص سازی آنزیم به میزان زیادی پروتئین های غیرمرتبط را کاهش داد و تغلیظ یکی از باندها که زیرواحدی از آنزیم مورد هدف بود، را باعث شد. در بخش پروتئینی به طور نسبی خالص شده، نشان داده شد که علاوه بر فعالیت تلوریت ردوکتازی، فعالیت سلنیت و نیترات ردوکتازی نیز در این بخش وجود دارد.
این پژوهش، در مسیر شناسایی بیشتر فیزیولوژی میکروارگانیسم های هالوفیل و بررسی آنزیم دخیل در احیای تلوریت گام برداشته و آنزیم مسوول را در باکتری مربوطه بهینه و تا حدی خالص سازی کرده است.

افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز از منابع میکروبی همواره مورد توجه پژوهشگران بوده است. مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر عوامل جهش زای القایی کلاسیک بر افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز باسیلوس موجاونسیس، به منظور دست یافتن به سویه های پر تولید انجام شد. در این تحقیق، ضمن نشان دادن توانایی باسیلوس موجاونسیسPTCC 1723، به عنوان سویه ای جدید برای تولید آنزیم گزیلاناز، به منظور افزایش تولید آنزیم از روش جهش زایی کلاسیک استفاده شد. ایجاد جهش یافتگان با به کار بردن عوامل جهش زا نظیر اشعه فرا بنفش و اسید نیترو انجام شد. غربال اولیه با در نظر گیری بالاتر بودن شاخص H/C جهش یافتگان درمقایسه با باکتری والد، که معادل 1/6 بود، بر روی محیط آگار حاوی گزیلان انجام شد. از میان تعداد بیشماری کلونی تیمار شده، در جمع72 سویه جهش یافته با شاخص قطر هاله معادل و یا بالاتر از 1/6 انتخاب شدند. در مرحله بعدی غربال گری، میزان آنزیم تولید شده توسط جهش یافتگان در کشت مایع با مقدار آنزیم تولید شده توسط باکتری وحشی مقایسه شد. سپس، از بین 67 جهش یافته با توانایی تولید آنزیم بیشتر نسبت به باکتری والد، جهش یافته شماره 17 با توانایی تولید IU/mL 330/56 و جهش یافته شماره 43 با میزان تولید 319/58 انتخاب شدند که به ترتیب افزایش تولیدی معادل 3/45 و 3/3 برابر سویه والد نشان دادند.
در نهایت، این سویه ها به عنوان سویه های دارای جهش مثبت یا مطلوب و تحت عنوان جهش یافتگان پر تولید انتخاب و به عنوان سویه های دارای ارزش صنعتی در تولید آنزیم گزیلاناز نگه داری شدند.

باکتری های ریزوسفری محرک رشد گیاه که حاوی آنزیم (1- آمینو سیکلوپروپان -1- کربوکسیلیک اسید) دآمیناز هستند، می توانند برای بهبود رشد گیاهان به ویژه تحت شرایط تنش محیطی کاربرد داشته باشند. این تحقیق با هدف بررسی توان سویه های بومی در تولید آنزیم ACCدآمیناز انجام گرفت. از 8 نمونه خاک ریزوسفری و غیر ریزوسفری، کشت به روش تهیه رقت های متوالی در محیط های اختصاصی تهیه شد. به منظور آزمون نیمه کمی توان تولید ACCدآمیناز در جدایه های به دست آمده، قطر کلونی ها در پلیت به روش لکه گذاری پس از مایه کوبی و گرماگذاری در روزهای 1، 2 و 5 ارزیابی شد. توانایی تولید آنزیم ACCدآمیناز در سویه های منتخب، با استفاده از تراکم نوری رشد در طول موج 504 نانومتر در محیط های مناسب ارزیابی شد. میزان فعالیت آنزیمACC دآمیناز با تعیین غلظت آلفا کتوبوتیرات آزاد شده برای سویه های منتخب انجام گرفت. آزمون های بیوشیمیایی و میکروبیولوژیک برای شناسایی تمامی سویه های منتخب انجام شد. در نهایت، شناسایی سویه منتخب که دارای بیش ترین میزان فعالیت آنزیم بود، با تکثیر و تعیین توالی ژن 16S rRNA انجام گرفت.
تعداد 445 جدایه، خالص شد و با آزمون نیمه کمی توان تولید ACC دآمیناز، تعداد 17سویه انتخاب شد. بر اساس توانایی جدایه ها در تولید آنزیم، 9 سویه انتخاب شد و نتایج شناسایی مقدماتی نشان داد که سویه های منتخب به جنس های Pseudomonas، Bacillus و گروه Actinomycetes متعلق هستند. بررسی میزان فعالیت آنزیم نشان داد که سویه 12 Kot با بیش ترین مقدار فعالیت آنزیم به میزان 826/4369 نانومول آلفا کتوبوتیرات/میلی گرم پروتئین/ ساعت، در گروه سودوموناس های فلورسنت و به گونه Pseudomonas brassicacearum متعلق هستند.
با توجه به فعالیت در خور توجه آنزیم ACCدآمیناز در این سویه بومی به دست آمده (826/4369 نانومول آلفا کتوبوتیرات/میلی گرم پروتئین/ ساعت) در مقایسه با سویه های مشابه، می توان با بهینه سازی شرایط تولید آنزیم و تهیه فرمولاسیون مایه تلقیح بر پایه باکتری محرک رشد گیاه به منظور استفاده در مزرعه بهره گرفت.

وجود پالایشگاه های متعدد در ایران، اهمیت تصفیه پساب را توجیه می کند. ریز جلبک ها با توجه به تنوع و کاربرد فراوان، در این امر برتری دارند. از ریزجلبک های موثر، می توان به باسیلاریوفایت، که به دیاتومه ها معروف هستند، اشاره کرد که از نظر اکولوژی بسیار موفق هستند. بهترین روش، جستجوی دیاتومه ها در محل آلودگی است. با توجه به مطالعات پالمر، با شناسایی گونه های مقاوم، می توان از آن ها به عنوان یک شاخص آلودگی آلی، برای تخمین کیفیت آب استفاده کرد. محاسبه حجم زیستی هر سلول، به عنوان اندازه گیری توده زیستی نسبی است. با مطالعه دیاتومه های سیستم تصفیه پساب خروجی شرکت پالایش نفت کرمانشاه، علاوه بر کمک به غنای گونه ای کشور، می توان گونه های مقاوم به آلودگی نفتی را شناسایی و معرفی کرد، تا در مطالعات بعدی برای تصفیه زیستی استفاده شود. از 6 ایستگاه تعیین شده در سیستم تصفیه پساب شرکت پالایش نفت کرمانشاه، نمونه برداری انجام شد. پس از انتقال به آزمایشگاه و با تهیه سری رقت از نمونه ها در محیط بی جی مایع، و در طی پاساژهای متوالی و متعدد ریزجلبک ها خالص شدند. سپس، دیاتومه ها با کلونی های قهوه ای در پلیت های جدید پاساژ داده شدند. نمونه ها توسط میکروسکوپ نوری و با استفاده از کلید های شناسایی معتبر، شناسایی شدند. میانگین مساحت و حجم زیستی سلول ها، بر حسب میکرو متر مربع با استفاده از روش هیلبراند، محاسبه شد.
عدم رشد باکتری در محیط نوترینت آگار پس از 48 ساعت، نشان دهنده موثر بودن روش خالص سازی به کار برده شده با استفاده از آنتی بیوتیک کلرامفنیکل بود. همچنین، در این پژوهش، با استفاده از کلید های شناسایی معتبر رده های مختلفی از دیاتومه ها شناسایی شد، که بیشتر به جنس های نویکولا، نیتزسشیا و فراستولیا متعلق بودند. در میان جنس ها و گونه های شناسایی شده، گونه فراجیلاریا کاپوسینا دارای بیش ترین حجم زیستی در سلول بود.
در بررسی جنس ها و گونه های سیستم تصفیه پساب شرکت پالایش کرمانشاه، به علت آلودگی، تنوع دیاتومه ها بسیار پایین بود. بسیاری از جنس های شناسایی شده مطابق با گزارشات قبلی بود. فراجیلاریا کاپوسینا حجم بیشتر توده زیستی نسبی را تشکیل داد. بر طبق جنس های شناسایی شده و شاخص پالمر، پساب خروجی شرکت پالایش نفت کرمانشاه، آلودگی کمابیش بالایی دارد. همچنین، با توجه به این پژوهش، می توان جنس های فراجیلاریا و پینولاریا را به عنوان جنس های جدید مقاوم به آلودگی نفتی گزارش کرد.

قارچ ها به ویژه برخی از گونه های پنی سیلیوم و آسپرژیلوس از دلایل اصلی آلودگی محصولات لبنی هستند که به علت تولید مایکوتوکسین ها، سلامت عمومی جامعه و امنیت غذا را تهدید می کنند. هدف از این تحقیق، جداسازی، شناسایی قارچ های ساپروفیت آلوده کننده محصولات مختلف لبنی اصفهان و بررسی توزیع فراوانی آلودگی کپکی (بیش از حد مجاز) نمونه های لبنی در مقایسه با حد مجاز استاندارد ملی ایران (2406) درسال 1391 بود. در این بررسی، 200 نمونه مختلف از محصولات لبنی پاستوریزه شامل:70 نمونه پنیر، 60 نمونه دوغ، 40 نمونه ماست، 20 نمونه کشک و 10 نمونه خامه از مناطق مختلف شهر اصفهان جمع آوری و از نظر وجود قارچ های ساپروفیت بررسی شدند. جداسازی، شناسایی و شمارش کپک به روش پور پلیت و اسلاید کالچر انجام شد. سپس، نتایج با حد مجاز استاندارد ملی ایران مقایسه و با استفاده از برنامه SPSS نسخه 16 و تحلیل آماری مربع کای تجزیه و تحلیل شد.
در مجموع 117 (58/5درصد) نمونه مطلوب، 50 (25 درصد) نمونه قابل قبول و 33 (16/5 درصد) نمونه غیرقابل قبول بودند. بیش ترین آلودگی کپکی (بیش از حد مجاز) به ترتیب در پنیر، خامه، کشک، دوغ و ماست مشاهده شد. قارچ های جنس پنی سیلیوم، آسپرژیلوس، کلادوسپوریوم و آکرمونیوم در نمونه ها شناسایی شدند. نتایج آزمون آماری اختلاف معنی داری را بین میزان آلودگی کپکی و نوع فرآورده لبنی نشان نداد (Pvalue<0/05).
با توجه به نتایج این تحقیق، لازم است در راستای کنترل آلودگی قارچی محصولات لبنی، بدون استفاده از نگهدارنده ها اقدامات جدی انجام شود.

باکتری لاکتوکوکوس گارویه عامل بیماری لاکتوکوکوزیس در ماهی است که قابلیت انتقال به انسان در صورت تماس یا مصرف ماهی آلوده را دارد. این عامل در سال های اخیر شیوع زیادی در مزارع پرورش ماهی داشته است. در این مطالعه، فراوانی و مقاومت دارویی لاکتوکوکوس گارویه در مزارع پرورش ماهی قزل آلای رنگین کمان استان چهارمحال و بختیاری بررسی شد. در مجموع 100 عدد ماهی از 33 مزرعه پرورش ماهی در تابستان 1392 جمع آوری و در شرایط مناسب به آزمایشگاه ارسال شد. جدایه ها پس از کشت و جداسازی با استفاده از روش های بیوشیمیایی و سپس، واکنش زنجیره ای پلیمراز شناسایی شدند. نتایج نشان داد که ماهیان 23 از 33 مزرعه پرورش ماهی بررسی شده به لاکتوکوکوس گارویه آلوده بودند. در مجموع 49 جدایه از ماهیان جداسازی و تشخیص داده شد. همچنین، نتایج نشان دهنده مقاومت چندگانه همه جدایه ها به آنتی بیوتیک های رایج بود. حداقل و حداکثر مقاومت دارویی در مورد آنتی بیوتیک های جنتامایسین و انروفلوکساسین به ترتیب 30/7 و 65/4 درصد مشاهده شد.
آلودگی بیش از 76 درصد مزارع پرورش ماهی بررسی شده در این مطالعه و همچنین، مقاومت دارویی عامل بیماری به آنتی بیوتیک ها خطر جدی برای صنعت پرورش ماهی و همچنین بهداشت عمومی به حساب می آید. علاوه بر آن، قابلیت ایجاد آلودگی در انسان و مشکلات بی شمار ناشی از انتقال مقاومت دارویی به سایر باکتری ها اهمیت کنترل این بیماری و نظارت بر مصرف آنتی بیوتیک ها در مزارع پرورش ماهی را دوچندان می کند.

آلفا آمیلاز یکی از آنزیم های تجاری مهم در میان آنزیم های هیدرولیز کننده نشاسته است. استفاده از آمیلاز باکتریایی در صنایع مختلف به دلیل مزایای آن نسبت به آمیلاز های حاصل از منابع گیاهی و حیوانی، از اولویت بیشتری برخوردار است. همچنین، استفاده از محصولات کشاورزی و بقایای آن ها به عنوان سوبستراهای تخمیری ارزان قیمت، اهمیت شایانی برای کاهش هزینه های تولید صنعتی این آنزیم دارد. هدف اصلی این تحقیق، بهینه سازی تولید آلفا آمیلاز توسط باسیلوس آمیلولیکویی فسینز با استفاده از منابع کشاورزی ارزان قیمت و با روش سطح پاسخ بود. تاثیر مقادیر مختلف منبع کربنی (عصاره نخود فرنگی) و منبع نیتروژنی (کنجاله تخم پنبه) بر روی تولید آلفا آمیلاز توسط باسیلوس آمیلولیکویی فسینز با استفاده از روش آماری سطح پاسخ بررسی شد. منابع کربنی و نیتروژنی طی تخمیر غوطه وری در 5 سطح در نظر گرفته شدند و از طرح مرکب مرکزی با 10 آزمایش استفاده شد.
بهترین شرایط برای حداکثر تولید آلفا آمیلاز توسط باسیلوس آمیلولیکویی فسینز، غلظت 75 گرم بر لیتر عصاره نخود فرنگی و 33/3 گرم بر لیتر کنجاله تخم پنبه بود که در این شرایط آلفا آمیلاز به میزان 69/74 واحد در میلی لیتر تولید شد. در بهینه سازی با روش سطح پاسخ مشخص شد که با وجود اهمیت منبع کربنی (عصاره نخود فرنگی)، میزان منبع نیتروژنی مورد استفاده (کنجاله تخم پنبه) اثر بیشتری در تولید آلفا آمیلاز باکتریایی در تخمیر غوطه وری نسبت به منبع کربنی داشته است.
این پژوهش نشان دهنده اهمیت رابطه بین سطح منبع نیتروژنی و منبع کربنی در تولید آلفا آمیلاز است. بر اساس نتایج به دست آمده، روش سطح پاسخ برای بهینه سازی شاخص های فرایند تخمیر غوطه وری به منظور دستیابی به حداکثر میزان تولید آلفا آمیلاز توسط باکتری مورد استفاده، کارایی مطلوبی داشته است.

بیماری های باکتریایی از جمله دلایل اصلی خسارت در گیاهان به شمار می آیند. در این میان، باکتری عامل بیماری شانکر مرکبات (Xanthamonas citri ssp. citri (Xcc کشت لیمو در سراسر دنیا را تحت تاثیر خود قرار داده است. توانایی آنتاگونیستی ترکیبات ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچAspergillus awamori K-03 علیه 26 سویه از باکتری Xanthomonas citri ssp. citri با استفاده از روش دیسک بر روی محیط PDA بررسی شد. همچنین، طیف بازدارندگی این ترکیبات ضد میکروبی بر علیه باکتری های گرم مثبت و گرم منفی دیگر از جمله Escherichia coli، Bacillus subtilis، Erwinia amylovora و Pseudomonas fluorescense و دو پاتوژن مهم انسانی Salmonella typhi و Staphylococcus aureus ارزیابی شد.
ترکیبات ضد میکروبی موجود در سکروتوم قارچ A. awamori K-03 توانایی کنترل کنندگی باکتری های مورد مطالعه در این آزمایش را داشت و توانست ویژگی های ضد میکروبی خود را در برابر گرما و همچنین، طیفی از اسیدیته های اسیدی و قلیایی حفظ کند.
نتایج بررسی های ما در شرایط آزمایشگاهی ثابت کرد که می توان از ترکیب ضد میکروبی موجود در عصاره خام قارچ K-03 A. awamori به عنوان عاملی برای بیوکنترل باکتری های پاتوژن استفاده کرد.

نانو ذرات اکسید روی به طور وسیع در صنعت، لوازم آرایشی، بهداشتی و پزشکی استفاده می شوند. بررسی های زیادی بر روی فعالیت ضد میکروبی نانو ذرات متمرکز انجام شده است، اما اطلاعات اندکی در مورد مقاومت باکتری ها در برابر آن ها در دسترس است. جدایه های سودوموناس مقاوم به نانو اکسید روی از نمونه های خاک جمع آوری شده از مناطق مختلف از جمله معدن مس سرچشمه کرمان جداسازی شد. جدایه انتخاب شده به وسیله تحلیل توالی ژن 16S rRNA شناسایی شد. اثر نانو ذرات اکسید روی بر روی سرعت رشد باکتری بررسی شد. یون های محلول روی آزاد شده از نانو ذرات اکسید روی به وسیله اسپکتروفتومتری جذب اتمی اندازه گیری شد. بخشی از توالی ژن مقاوم به روی (czcC) تکثیر شده و به وسیله تحلیل فیلوژنتیکی توالی پروتئین آن شناسایی شد.
تحلیل فیلوژنتیکی بر اساس توالی ژن 16S rRNA نشان داد که جدایه انتخاب شده Pseudomonas sp. ZnO-2 است. الگوی رشد جدایه انتخاب شده در حضور تمام غلظت های نانو اکسید روی مورد بررسی، مشابه نمونه کنترل (کشت فاقد نانو ذرات) بود که نشان می دهد نانو ذرات اکسید روی رشد جدایه جداسازی شده را تحت تاثیر قرار نداده است. PCR ژن czcC و الکتروفورز نشان داد که Pseudomonas sp. ZnO-2 دارای این ژن است.
در طی فرآیند تکامل، میکروارگانیسم ها مکانیسم های مقاومت به فلزات خود را برای سازگاری با محیط های مختلف بهبود می بخشند. وجود ژن czcC به وسیله PCR تایید شد که شباهت زیادی با ژن های مقاوم به روی در باکتری های دیگر نشان می دهد.

در سال های اخیر احتمال انتقال کلستریدیوم دیفیسیل با مصرف مواد غذایی به انسان با افزایش عفونت این باکتری در جامعه مطرح شد. در این میان پژوهش های گسترده تری از وضعیتکلستریدیوم دیفیسیل در گوشت قرمز کشور های مختلف دنیا نسبت به مواد غذایی دیگر انجام شد. مطالعه حاضر با هدف بررسی شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت گوساله انجام گرفت. 100 نمونه از گوشت گوساله عرضه شده در دو شکل تکه ای و چرخ کرده از قصابی های مناطق مختلف شهراصفهان برای انجام آزمایش ها جمع آوری شد. پس از انجام مراحل کشت و تایید پرگنه های مثبت کلستریدیوم دیفیسیل با آزمون های بیوشیمیایی، روش مولکولی PCR با تکنیک چندتایی جهت تشخیص سه ژن ایزومراز تری فسفات، زهرابه آو زهرابه ب انجام گرفت. بررسی ارتباط بین شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در دو شکل تکه ای و چرخ کرده گوشت گوساله در نرم افزار آماری SPSS (ویرایش 16) با آزمون مربع کای در سطح معنی داری Pvalue<0.05 انجام گرفت.
کلستریدیوم دیفیسیل در 12 نمونه (12 درصد) از گوشت های گوساله جداسازی شد. از بین 12 نمونه، دو نمونه (4 درصد) به گوشت تکه ای و 10 نمونه (20 درصد) به گوشت چرخ کرده مربوط بود. همه پرگنه های جداسازی شده از هر سه ژن مورد بررسی برخوردار بودند. تفاوت معنی داری در شیوع کلستریدیوم دیفیسیل در دو نوع از گوشت های مورد بررسی مشاهده شد (0/01=Pvalue).
در این مطالعه، میزان جداسازی کلستریدیوم دیفیسیل در گوشت های چرخ کرده گوساله نسبت به شکل تکه ای افزایش داشت که می تواند به علت عدم رعایت اصول بهداشتی در شست و شو و تشکیل احتمالی بیوفیلم در دستگاه های چرخ گوشت باشد. همچنین، نتایج این مطالعه نشان داد که مصرف گوشت گوساله به عنوان یک مخزن احتمالی از کلستریدیوم دیفیسیل در انتقال این باکتری به انسان می تواند عمل کند.