Cell Journal (Yakhteh)
Volume:7 Issue: 3, 2005

مطالعه و مقایسه بیان پروتئین های (Association Transcription Factor-2) ATF-2 وP38 در سلولهای کورتکس جنین رت (Rat) بعد از القای مرگ سلولی توسط صدمه به DNA در این مطالعه تجربی کورتکس جنین های رت 14 تا 16 روزه خارج شد. پس از آن سلول ها به شکل سوسپانسیون سلولی در آمدند. سپس تعداد 105×2/1 سلول نورونی حاوی محیط کشت بدون سرم بر روی ظروف کشت پوشش شده با Poly-D-Lysine کاشته شدند. 24 ساعت پس از کشت، تیمار با Camptothecin) مهار کننده توپوایزومراز I) در غلظت 5-10 مولار انجام گرفت. پس از گذشت 4، 6، 24 و 48 ساعت، با استفاده از آنتی بادی اولیه، بیان ATF-2 و P38، با تکنیک ایمونوسیتوشیمی بررسی گردید. ارزیابی هسته توسط بافر لیز کننده و شمارش هسته زنده و مرده انجام شد. مطالعه و شمارش نورونها با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت و نوری انجام شد. سپس آنالیز آماری بر اساس آنوای یک طرفه (One-Way ANOVA) و Post Test به طریق توکی (Tukey) بر روی درصد سلولهای زنده و درصد سلولهای بیان کننده انجام گرفت.
میزان بیانP 38 در گروه تیمار شده با Camptothecin برای زمان های 4، 6، 24 و 48 ساعت به ترتیب 4، 20، 40 و 55 درصد و میزان بقا به ترتیب 95، 85، 64 و 50 درصد، و میزان بیان ATF-2به ترتیب 3، 20، 30 و 45 درصد است و میزان بقا به ترتیب 97، 85، 64 و50 درصد است. درصد بیان P38 و بقای نورون ها در ساعت 24 به ترتیب (40 و 64 درصد) و درصد بیانATF -2 و بقای نورون ها به ترتیب (30 و 64 درصد) در مقایسه با کنترل افزایش معنی داری در سطح P<0.05 را نشان می دهد. بیان پروتئین ها، در 4 ساعت تغییر معنی داری نشان نمی دهد.
نتایج نشان می دهد که بیان پروتئین ATF-2 و P 38 افزایش پیدا می کند و افزایش بیان P38 همراه با افزایش بیان ATF-2 است، بنابراین Camptothecin در این مدل، موجب مرگ نورونی از طریق تحریک مسیر P38-ATF-2 می شود

بررسی تغییرات متابولیت های مختلف سلولی و تولید آدنوزین منوفسفات حلقوی (cAMP) در پاسخ به تحریک آدنیلیل سیکلاز به دنبال وابستگی به مورفین در هسته پاراژیگانتوسلولاریس (PGi) موش صحرایی برش هایی به ضخامت 5/3 میلیمتر از محل هسته PGi مغز موش وابسته به مورفین و کنترل (درهریک از گروه ها5 =n) تهیه شد. این برش ها در یک حمام بافتی تحت تاثیر فورسکولین (50 میکرومول)+ IBMX (500 میکرومول) قرار گرفتند. پس از استخراج عصاره بافتی به روش اسید پرکلریک، میزان cAMP، ATP و فسفوکراتین (PCr) توسط روش 31P-NMR و میزان اسید لاکتیک، آلانین، تورین، گابا، گلوتامات، گلوتامین و -N استیل اسپارتات توسط روش 1H-NMR در آن اندازه گیری شد.
در موش های وابسته به مورفین محتویcAMP در پاسخ به فورسکولین و IBMX در مقایسه با کنترل افزایش معنی داری (P<0.05, t-test) را نشان داد و محتوی ATP، PCr، اسید لاکتیک و آلانین از میان 9 ترکیب اشاره شده در بالا در گروه های وابسته در مقایسه با کنترل کاهش معنی داری (P<0.05, t-test) را نشان داد.
به نظر می رسد تنظیم افزایشی cAMP ناشی از تغییر در فعالیت آنزیم آدنیلیل سیکلاز یکی از مکانیسم های اصلی بیولوژیکی پدیده وابستگی و محرومیت از مورفین را در یاخته های عصبی هسته PGi شکل می دهد. همچنین وابستگی به مورفین در این حالت هیچ گونه تخریب غشایی یا مرگ یاخته عصبی را در سلول های این هسته سبب نشده اما تغییرات متابولیکی چشم گیری به دنبال وابستگی به مورفین در یاخته عصبی این هسته به وقوع پیوسته است

بررسی اثر مقلد آنزیم سوپر اکساید دسموتاز (MnTBAP) بر ضایعات ناشی از ایسکمی- پرفیوژن مجدد در کلیه موش صحرایی در این مطالعه تجربی ابتدا موش های صحرایی بیهوش شده با پنتوباربیتال سدیم تراکئوتومی شدند. سپس شریان فمور کانول گذاری، فشار متوسط شریانی و تعداد ضربان قلب در تمام مدت آزمایش توسط سیستم PowerLab ثبت گردید. انفوزیون سالین به میزان 6 میلی لیتر بر کیلوگرم در ساعت از طریق ورید فمور برقرار شد. مثانه نیز کانول گذاری و ادرار در تمام مدت پرفیوژن مجدد جمع آوری گردید. سپس با ایجاد یک برش شکمی، شریان هر دو کلیه از بافت های اطراف به دقت جدا شد. بعد از اتمام جراحی و یک دوره استراحت 60 دقیقه ای رت ها به طور تصادفی در چهار گروه Sham+MnTBAP،Sham-Operated،IR و IR+MnTBAP قرار گرفتند. در گروه های (Ischemia-reperfusion: IR)، شریان هر دو کلیه به مدت 40 دقیقه توسط کلمپ بولداگ مسدود و سپس 6 ساعت پرفیوژن مجدد برقرار شد. رت ها 15 دقیقه قبل از زمان ایسکمی، 10)MnTBAPمیلی گرم بر کیلوگرم) به صورت بولوس وریدی یا سالین دریافت کردند. عملکرد کلیه با اندازه گیری BUN، کراتینین پلاسما، آسپارتات آمینوترانسفراز، کسر دفع سدیم و فعالیت آنزیم ان-استیل بتا دی گلوکوزامینیداز ادرار ارزیابی شد. از روش آنالیز واریانس یک طرفه به منظور ارزیابی داده ها استفاده شد.
نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که MnTBAP، به طور معنی داری از افزایش شاخص های BUN، کراتینین پلاسما، آسپارتات آمینوترانسفراز، کسر دفع سدیم و فعالیت آنزیم ان-استیل بتا دی گلوکوزامینیداز ادرار ناشی از ضایعات ایسکمی پرفیوژن مجدد جلوگیری می نماید.
این نتایج پیشنهاد می کند که مهار گونه های فعال اکسیژن به ویژه آنیون O2-با استفاده از یک SOD mimetic می تواند ضایعات ناشی از IR را کاهش دهد. با توجه به اینکه اثرات سمی از MnTBAP گزارش نشده است و امکان مصرف آن به صورت خوراکی وجود دارد و در مدل های مختلف استرس اکسیداتیو در شرایط in vivo موثر بوده است، استفاده از آن در پروتکل درمانی مقابله با ضایعات ناشی از IR در مطالعات مقدماتی بالینی پیشنهاد می شود.

مقایسه فعالیت و مشخصات سینتیکی آنزیم لاکتات دهیدروژناز استخراج شده از کاردیومیوسیت های مشتق از سلول های بنیادی جنینی موش و کاردیومیوسیت های نوزاد موش پس از کشت و تمایز سلول های بنیادی جنینی به کاردیومیوسیت ها و نیز جداسازی کاردیومیوسیت ها از قلب نوزاد موش و انجام مطالعات ایمونوسیتوشیمیایی به منظور استخراج آنزیم، سلول ها با سونیکاتور، لیز و بررسی مشخصات سینتیکی به کمک روش های سنجش آنزیمی انجام شد.
تست ایمونوسیتوشیمی وجود و درصد خلوص بالای سلول های عضله قلبی را در دو نمونه تایید کرد. پس از مشاهده فعالیت آنزیم به روش اسپکتروفوتومتری، ثابتهای سینتیکی برای سوبسترایNAD+ در دو نمونه محاسبه شد. در کاردیومیوسیت های مشتق ازسلول های بنیادی جنینی فعالیت ویژه 16.78±1.02 μmol min-1 mg-1(Specific activity) و Km برابر 0.37±0.03 و در سلول های عضله قلبی نوزاد موش فعالیت ویژه 29.41±1.87 μmol min-1 mg-1 و Km برابر 0.69±0.04 (r2>0.95) به دست آمد.pH بهینه هر دو نمونه در واکنش رفت برابر 8 بوده و بیشترین میزان فعالیت ویژه آنزیم حاصل از سلول های بنیادی در دمای 65درجه سانتی گراد و نمونه طبیعی در دمای 60 درجه سانتی گراد به دست آمد.
در این مقایسه اختلاف در خصوصیات سینتیکی دو نمونه مشاهده شد

بررسی تاثیر عصاره گیاه دافنه ماکروناتا بر رهایی فاکتور نکروز دهنده بافتی آلفا و تعداد گیرنده های این فاکتور بر روی مونوسیت های انسانی در محیط کشت توسط دی متیل بنزآنتراسن (DMBA) تومور پستان در رت های ماده ایجاد شد. تاثیر خوراکی عصاره دافنه ماکروناتا بر کاهش حجم و حذف تومورهای مذکور بررسی شد. جهت جداسازی و خالص نمودن مونوسیت های انسانی از روش چسبندگی و گرادیان دانسیته بهره گرفته شد. اندازه گیری فاکتور نکروز دهنده بافتی آلفا توسط روش حساس الایزای بیوتین استرپتواویدین با و بدون استفاده از LPS صورت گرفت. بررسی تعداد گیرنده های فاکتور نکروز دهنده بافتی آلفا توسط نشان دارسازی رادیواکتیوی به کمک ید 125 و دستگاه گاماکانتر انجام شد.
تجویز خوراکی عصاره گیاه دافنه ماکروناتا به مدت 20 روز متوالی سبب حذف و یا کاهش شدید اندازه تومور پستان در رت های آزمایشگاهی شد. این عصاره در مسیری وابسته به دوز سبب تحریک و افزایش ترشح فاکتور نکروز دهنده بافتی آلفا گردید. در مسیری وابسته به زمان در کمتر از 2 ساعت عصاره دافنه ماکروناتا باعث تنظیم کاهشی شدید تعداد گیرنده های فاکتور نکروز دهنده بافتی آلفا بروی مونوسیت ها در محیط کشت گردید. در مقایسه داده های دو گروه از آزمون آماری t-student استفاده شد و اختلافات مورد بررسی با p<0.001معنی دار بودند.
عصاره آب الکلی گیاه دافنه ماکروناتا سبب کاهش شدید تومورهای آدنوکارسینومای پستان رت می گردد. در بررسی مکانیزم عمل این عصاره معلوم شد که عصاره مذکور، سبب تحریک رهایی فاکتور نکروز دهنده بافتی آلفا توسط مونوسیت ها در محیط کشت می گردد و در ضمن این عصاره سبب تنظیم کاهشی تعداد گیرنده های فاکتور نکروز دهنده بافتی آلفا در سطح مونوسیت های انسانی می گردد

ارزیابی اثرات واریکو سلکتومی بر باروری از طریق بررسی پارامترهای اسپرمی و وضعیت کروماتین اسپرم به مدت دو سال علاوه بر آنالیز پارامترهای اسپرمی، کمبود پروتامین، حضور هیستون اضافی، پایداری کروماتین و توانایی اسپرم برای غیر متراکم شدن به ترتیب با روش رنگ آمیزی کرومومایسین A3، آنیلبن بلو، روش SDS و SDS+EDTA و در 35 بیمار به مدت دو سال بررسی شد.
نتایج این مطالعه با استفاده از آزمون Student-t-test نشان داد که از میان پارامترهای اسپرمی تنها حرکت اسپرم و از بین تست های مذکور کمبود پروتامین و حضور هیستون اضافی در ساختار کروماتین اسپرم بهبود قابل توجهی پس از عمل داشته است. (P<0.05) میزان حاملگی افزایشی در این مطالعه 7/25درصد بود. نتایج به دست آمده از بیمارانی که همسرانشان بارور شده اند در مقایسه با کسانی که پس از انجام واریکوسلکتومی همسرانشان بارور نگردیده اند، نشان می دهد بیمارانی از واریکوسلکتومی نتیجه می گیرند که کمبود پروتامین اسپرم و حضور هیستون اضافی در ساختمان کروماتین 3 ماه پس از عمل کاهش یافته باشد. (P<0.05) نتایج این مطالعه به بیمارانی که تحت عمل واریکوسلکتومی قرار می گیرند توصیه می نماید در صورتی که کمبود پروتامین و یا حضور هیستون اضافی 3 ماه پس از عمل بهبود نیابد از روش های نوین نازایی مانند IVF و ICSI استفاده نمایند

بررسی اثر غلظت های متفاوت از اسکوربات)ویتامینC) بر ساختار غشاء، درصد سلول های فعال، و واکنش اکروزومی اسپرم های انسان در محیط های حاوی یون های فروس (Fe2+)، به عنوان محرک پراکسیداسیون چربی های غشاء (Lipid Peroxidation: LPO) تعداد 12 نمونه اسپرمی از افراد سالم ساکن در شهرستان شهرکرد، به صورت داوطلبانه، اخذ و جمع آوری گردید. نمونه های مذکور پس از شستشو با محلول رینگرتایرود دو بار مورد عمل سانتریفوژ (500xg، هر بار به مدت 10 دقیقه(قرار گرفته تا پلاسمای منی از سلول های اسپرم به طور کامل جدا گردد. رسوب های اسپرمی حاصله (حل شده در حداقل رینگر) درمراحل بعدی پژوهش مورد استفاده قرار گرفتند. به منظور بررسی میزان پراکسیداسیون چربی های غشا (LPO) میزان مالون دی آلدیید (Malondialdehyde: MDA) تولید شده در محیط با روش اسپکتروفوتومتری مورد سنجش قرار گرفت. آزمایش رنگ آمیزی با ائوزین نیز با هدف تعیین درصد تعداد سلول های اسپرم زنده و غیرزنده در طی سه ساعت انکوباسیون، مورد استفاده قرار گرفت. به منظور بررسی چگونگی عملکرد سلول های اسپرم در واکنش آکروزومی بر اساس آزمایش هضم ژلاتین عمل شد و بدین منظور اسپرم های تیمار شده با آهن و یا اسکوربات به لام های ژلاتین دار اضافه شده و در آخر به کمک کوماسی بلو رنگ آمیزی گردیدند. تعداد سلول های اسپرم واجد هاله (محل هضم ژلاتین در نتیجه واکنش اکروزومی در اطراف سر اسپرم ها) و نیز سلول های بدون هاله شمارش و ثبت گردیدند. در این پژوهش روش آماری t-test مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج این پژوهش نشان داد که کاربرد یون های آهن موجب افزایش میزان رادیکال های آزاد در محیط حاوی اسپرم ها شد. اسکوربات در غلظت های کمتر از 1000 میکرومولار موجب کاهش روندLPO (کاهش معنی داری در میزان (MDA، افزایش واکنش های اکروزومی (افزایش هاله ها)، و نیز بالا رفتن درصد اسپرم های فعال در محیط گردید. از سوی دیگر، اسکوربات در محدوده غلظتی1000 میکرومولار و بیشتر ازآن پس از ایجاد کمپلکس با یون های آهن، به عنوان یک پرواکسیدان عمل نموده و موجب بروز آسیب های شدید در ساختار غشای اسپرم ها)افزایش میزان (MDA، کاهش در میزان درصد واکنش های اکروزومی، و نیز کاهش تعداد اسپرم های فعال گردید.
در مجموع، اسکوربات در غلظت های مختلف اثرات متفاوتی داشته و محققین با عنایت به این رویکرد منفی از اسکوربات، می بایست آن را در زمینه هایی نظیر لقاح آزمایشگاهی، کشت سلولی و نگهداری و ذخیره سازی سلول های جنسی، به طور جدی مورد نظر قرار داده تا اثرات مخرب آن را در سیستم های زیستی به حداقل رسانند.

بررسی تاثیر فاکتور رشد فیبروبلاستی بر تمایز کاردیومیوسیت های حاصل از سلول های بنیادی جنینی موش و خصوصیات فارماکولوژیکی آنها تعداد 800 سلول بنیادی جنینی موش(RoyanB1) در قطرات آویزان و در پتری دیش کشت شدند. پس از دو روز سلول های (Embryonic Stem: ES) در هر قطره جمع شده و تشکیل اجسام شبه جنینی (Embryoid Body: EB)را دادند. به دنبال آن EB ها به مدت پنج روز دیگر در ظروف باکتریایی کشت شدند. در دو روز اول، سلول ها با 10 نانوگرم بر میلی لیتر فاکتور رشد فیبروبلاستی(basic Fibroblast Growth Factor: bFGF) تیمار شدند. سپس EBها در ظروف 24 خانه کشت شدند. تعداد ضربان در دو گروه کنترل وbFGF هر روز شمارش شد و تاثیر داروهای کرونوتروپی ایزوپرنالین و فنیل افرین وکارباکول بر کاردیومیوسیت های حاصل در روزهای 3+7، 7+7، 14+7 بررسی شد. همچنین بیان ژن های خاص قلبی از جمله (Myosin Light Chain) MLC-2V,? -MHC, (Myosin Heavy Chain)? -MHC (Atrial Natriuretic Factor) ANF، ?-Tubulin، oct-4در روز 14+7 در دو گروه کنترل و bFGF با استفاده از RT-PCR ارزیابی شد. به علاوه ایمونوهیستوشیمی با رنگ آمیزی کاردیومیوسیت ها با آنتی بادی علیه actinin-? انجام شد.
نتایج شمارش روزانه نشان داد کهEBهای گروه کنترل تعداد ضربان در دقیقه بیشتری نسبت به گروه bFGF دارند. همچنین تست فارماکولوژیکی نشان داد که افزایش تعداد ضربان در دقیقه در پاسخ به ایزوپرنالین و فنیل افرین در مراحل اولیه تکوین (روز 3+7) در گروه bFGF نسبت به گروه کنترل بیشتر بود (P<0.019,P<0.035) داروی کارباکول سبب کاهش تعداد ضربان در دقیقه در هر دو گروه شد اما تفاوتی در میزان ضربان هر دو گروه دیده نشد. نتیجه آنالیزRT-PCR نشان داد که ژن های? -tubulin،? -MHC MLC-2V،?-MHC و ANF در روز 14+7 بیان شد اما تفاوتی در بیان ژن ها در دو گروه کنترل و bFGF دراین روز مشاهده نشد و oct-4 در هیج گروه بیان نشد همچنین ایمونوهیستوشیمی سازماندهی سارکومریک کاردیومیوسیت ها را در هر دو گروه نشان داد ولی تفاوتی در آرایش میوفیبریلی آنها دیده نشد.
از نتایج به دست آمده می توان استنباط کرد که bFGF با اینکه بر تجلی یا عملکرد گیرنده های -? 1آدرنرژیک و 1? - آدرنرژیک در کاردیومیوسیت ها موثر است ولی با شرایط موجود به تنهایی در تمایز کاردیومیوسیت ها از سلول های بنیادی جنینی نقشی ندارد.

سلول های بنیادی جنینی اغلب از توده سلولی داخلی بلاستوسیست مشتق شده و دارای خصوصیت خودنوزایی (self-renewal) و توان تمایز به انواع سلول ها (pluripotent) هستند، به طوری که میتوانند مشتقات سه لایه زاینده جنینی را بسازند. در نتیجه این سلول ها ابزار ارزشمندی در مطالعات زیست شناسی تکوینی، طب پیوند، توسعه داروسازی، ناهنجاری شناسی و مطالعه عملکرد ژنها هستند. این مقاله به بیان ساده مفاهیم مطالعه سلول های بنیادی و کاربردهای بالقوه آنها می پردازد.