بررسی تکثیر ژن های vh و vl از منبع RNA تک پلاسماسل انسانی

نخستین نسل آنتی بادی های درمانی منوکلونال با منشا موشی موجب بر انگیختن پاسخ ایمونولوژیکی در بدن انسان می شود. استفاده از آنتی بادی درمانی کاملا انسانی علاوه بر کاهش ایمونوژنیسیته، بیشترین کارایی را به دنبال خواهد داشت. امروزه جهت تهیه آنتی بادی انسانی تکنیک های نمایش فاژی و روش های مبتنی بر تک سلولB، مورد توجه قرار گرفته است. هدف از این پژوهش تکثیر ژن های VHو VLاز منبع RNAپلاسماسل انسانی می باشد.
از واکنش RT-PCRبه منظور جداسازی و تکثیر قطعات ژن VHو VLاز تک پلاسماسل غربالگری شده علیه آنتیژن مورد نظر استفاده شد. در ابتدا با استفاده از بافر لیز کننده ی سلول، پلاسماسل ها لیز و جهت ساخت cDNAاستفاده گردیدند. ژن های آنتی بادی انسانی با استفاده از cDNAحاصل از یک پلاسماسل و مجموعه پرایمر های آنتی بادی تکثیر وشش جفت پرایمر جهت تکثیر نواحی متغیر زنجیره سنگین (VH) و سبک (VL) مورد استفاده قرار گرفتند. در این پرایمر ها جایگاه برش آنزیم های محدودالاثر جهت کلون نمودن در وکتور مربوطه و توالی لینکر جهت اتصال نواحی VHو VLقرار داده شد.
الکتروفورزطی واکنشPCRمشخص نموده کهقطعات VHو VLبه طول حدود bp400 به طور جداگانه تکثیر یافته اند. توالی های به دست آمده از ژن های آنتی بادی با سایر توالی های موجود در پایگاه NCBIمشابهت 97 درصدی نشان داد.
پرایمرهای مورد استفاده در این پژوهش به گونهای طراحی شدند که دارای توالی لینکر جهت تهیه ScFvو جایگاه برش آنزیم های NcoIو NotIجهت کلونینگ قطعات VHو VLهستند.