ساخت و تعیین خصوصیت سلول نوترکیب HEK با بیان بالای TOSO/FAIM3 و ارزیابی بیان آن

پروتئین های غشایی در فرآیندهای سلولی با ارزش شامل انتقال سیگنال، عبور و مرور مواد و ارتباطات سلولی نقش دارند و به منظور درمان بیماری ها و اختلالات، مورد هدف داروها قرار می گیرند. سیستم های بیانی متفاوتی برای تولید به میزان زیاد این پروتئین ها به کار رفته اند که سلول های پستانداران با تولید ساختارهای نزدیک به فرم طبیعی این پروتئین ها مناسب ترین آن ها هستند. (TOSO/FAIM3 (Fas Apoptosis Inhibitory Molecule، یک پروتئین غشایی به شدت حفاظت شده است که نقش مهمی در بقا، نظارت بر سیستم ایمنی و هموستاز بر عهده دارد. هدف از این مطالعه، بیان TOSO به میزان زیاد در سطح سلول HEK-293T می باشد.
وکتور بیانی یوکاریوتیک pEZ-M67-TOSO به منظور تکثیر پلاسمید در باکتری Escherichia coli سویه ی TOP10F’ ترانسفورم شد. سپس، پلاسمید استخراج شد و با آنزیم محدودالاثر Eco31I مورد هضم آنزیمی قرار گرفت تا پلاسمید خطی شود. پس از آن، سلول های HEK-293T با پلاسمید خطی ترانسفکت شدند و به منظور غربال گری سلول های پایدار بیان کننده ی TOSO، تحت تیمار با هیگرومایسین قرار گرفتند. کلون های مقاوم پس از سه هفته تکثیر شدند. سپس، DNA کروموزومی از سلول های ترانسفکت شده استخراج شد و حضور cDNA TOSO در ژنوم HEK-293T به وسیله ی روش (Polymerase chain reaction (PCR سنجش شد. علاوه بر این، برای بررسی میزان بیان Toso از روش Real-time PCR استفاده شد.
ورود cDNA TOSO در داخل ژنوم سلول های انتخاب شده، تایید گردید. سلول های HEK-293T، mRNA TOSO را به میزان متوسط 1700 مولکول در هر سلول بیان کردند.
سلول های HEK-293T، به دلیل سهولت در ترانسفکشن و رشد سریع، مناسب ترین گزینه برای بیان پروتئین می باشند. بیان غشایی پروتئین TOSO حتی نسبت به پروتئین نوترکیب خالص شده ازسیستم بیانی رده ی سلولی پستانداران نیز تاخوردگی طبیعی تری دارد. از رده ی سلولی HEK-293T ساخته شده در این تحقیق، که با بیان بالای TOSO همراه بود، در مطالعات بعدی جهت تعیین خصوصیت و ساختار بیوفیزیکی و بیوشیمیایی آن و تحقیقات دارویی و زیستی می توان استفاده نمود.