مهندسی پروتئین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA) انسانی با افزودن قطعه ژن کاسکوتین سس جهت افزایش پایداری و فعالیت آن

پروتئین tPA یک عامل اختصاصی فیبرین است که موجب حل کردن لخته های خونی و جلوگیری از سکته ه ی قلبی و مغزی می گردد. کاسکوتین یک پروتئاز با فعالیت و پایداری بالا می باشد که در گیاهانی مثل سس وجود دارد و گیاه پارازیت از آن برای نفوذ به میزبان استفاده می کند. هزینه تولید پروتئین های نوتوکیب در گیاهان 10 الی 50 برابر کمتر از تولید همان پروتئین توسط باکتری است. اما تولید پروتئین-های نوترکیب در گیاهان هنوز با چالش های مهمی از جمله عملیات پایین دستی و تخلیص، پایین بودن فعالیت و پایداری پروتئین روبرو می باشد. پروتئین نوترکیب tPA تولید شده در گیاهان پایداری و فعالیت پایینی دارد. هدف این تحقیق، افزایش پایداری tPA با استفاده از مهندسی پروتئین و افزودن جایگاه فعال آنزیم کاسکوتین از گیاه سس به tPA و تولید پروتئین شیمری می باشد. ابتدا از گیاه سس استخراج DNA صورت گرفت و سپس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی قطعه مورد نطر از ژن کاسکوتین تکثیر گردید. سپس به کمک تکنیک SOEing PCR قطعه کاسکوتین به ژن tPA متصل شد. قطعه tPA شیمری حاصله تحت کنترل پیشبر CaMV 35S و خاتمه دهنده NOS قرار گرفت. توالی افزایش دهنده Kozak و ترادف رمز کننده پپتید نشانه KDEL، به ترتیب به دو انتهای آمینی و کربوکسیلی ژن tPA افزوده شدند. سازه تهیه شده(pBI(tPA به روش انتقال ژن مبتنی بر اگروباکتریوم به ژنوم گیاه توتون منتقل و گیاهان تراریخت روی محیط حاوی کانامایسین انتخاب شدند. ارزیابی گیاهان تراریخت با استفاده از فنون PCR، RT-PCR، SDS-PAGE ، وسترن بلات و زیموگرافی انجام شد. نتایج نشان داد که ژن شیمریtPA به گیاهان توتون منتقل شده و در مقایسه با tPA نرمال فعالیت و پایداری آن بهبود یافته است. بنابراین مهندسی پروتئین و استفاده از بخش هایی از پروتئین های گیاهی با فعالیت و پایداری بالاتر جهت افزایش ماندگاری و فعالیت داروهای نوترکیب، می تواند راهکار جدیدی برای افزایش کارایی این داروها باشد.