توسعه DNA آپتامر به منظور شناسایی بروسلا آبورتوس و بروسلا ملیتنسیس به روش سلکس سلولی

پیشینه:

بروسلوز یک بیماری مشترک بین انسان و دام است، توسط گونه های بروسلا حادث می شود که کوکوباسیل های هوازی کوچک درون سلولی هستند، در اندام های تناسلی جانوران میزبان قرار می گیرند، باعث سقط جنین و عقیم شدن می شوند. شناسایی این بیماری بر مبنای روش های آزمایشگاهی میکروبیولوژی، سرولوژی و یا واکنش زنجیره ای پلیمراز زمان واقعی (RT-PCR) است. اگرچه آزمون های میکروبیولوژی و سرولوژی رایج مزایایی دارند، اما قادر به رفع مشکلات تشخیصی نیستند.

برای فایق آمدن بر برخی از محدودیت های تکنیک های موجود، در مطالعه حاضر ما یک آپتامر را از طریق روش تکامل سیستماتیک لیگاند از طریق غنی سازی نمایی (سلکس) در سلول کامل برای تشخیص بروسلا ایجاد کردیم.

ما از مخلوط بروسلا ملیتنسیس و بروسلا آبورتوس به عنوان هدف استفاده کردیم. به منظور تهیه آپتامر DNA  تک -رشته ای (ssDNA)، کتابخانه DNA با پرایمر معکوس ´5-فسفریله تقویت و با اگزونوکلیاز لامبدا تیمار شد. روش سلکس با انکوباسیون مجموعه ssDNA به همراه سوسپانسیون باکتریایی در بافر اتصال انجام شد. روش های منتخب، توسط فلوسایتومتری و با استفاده از پرایمر آغازگر پیش رو نشان دار شده با FITC کنترل شد. آپتامرهایی با بالاترین میل اتصال به سمت هدف و پایین ترین تمایل نسبت به سویه های دیگر انتخاب شدند.

دو آپتامر یعنی B20 و B21 میل اتصال قابل ملاحظه ای به بروسلا ملیتنسیس و بروسلا آبورتوس نشان دادند. ثابت تفکیک (Kd) برای آپتامرهای B20 و B21 به ترتیب 06/3 ± 179/40 pM و 465 ± 396/184 pM بود.

نتیجه گیری:

 آپتامرهای جدا شده قادر به شناسایی بروسلا ملیتنسیس و بروسلا آبورتوس با راندمان اتصال قابل توجه و Kd اختصاصی در محدوده پیکومول هستند و بنابراین می توانند کاندیدای مناسبی در جهت انجام هر آزمایش سنجش سریع در تشخیص معمول بروسلوز باشند.