بهینه سازی بیان آنزیم سلوبیوهیدرولاز cel6B در باکتری E. coli BL21(DE3)

مصرف انرژی و تاثیر آن بر محیط زیست یکی از بزرگترین چالش های بشر است و تولید اتانول زیستی یا سایر مواد شیمیایی به وسیله هیدرولیز آنزیمی سلولز می تواند تاثیر مهمی در جایگزینی سوختهای فسیلی و کاهش تولید CO2 در اتمسفر داشته باشد. آنزیم Cel6B از باکتری گرمادوست Thermobifidia fusca، یک CBHII متعلق به خانواده بی سلولازهاست که تا C° 55 مقاوم به حرارت است. به علت میزان پایین تولید این آنزیم در میزبان اولیه جهت مصارف صنعتی، ابتدا باید تولید آن در سیستم هایی نظیر باکتری، بهینه سازی شود. در این پژوهش، از آغازگرهای اختصاصی جهت تایید وجود ژن Cel6B در وکتور PSZ143 استفاده شد سپس وکتور PSZ143 حاوی ژن Cel6B با روش شوک حرارتی به سلول های مستعد E. coli BL21(DE3) منتقل شد. پس از استخراج پروتئین، بیان یک پروتئین با وزن مولکولی 59.6 KDa با استفاده از ژل الکتروفورز SDS-PAGE تایید شد. نتایج بهینه سازی تولید پروتئین نشان داد که بهترین زمان و بهترین غلظت IPTG برای القا و بیان پروتئین در باکتری به ترتیب 6 ساعت بعد از القا و 8/0 میلی مولار است. فعالیت آنزیم سلوبیوهیدرولاز با استفاده از سوبسترای پنبه پیش تیمار شده با اسید فسفریک در باکتری لیزشده با روش DNS مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت آنزیمی cel6B در هیدرولیز سلولز، در لیزات باکتری و محیط کشت آن پس از 6 ساعت القا با 8/0 میلی مولار از IPTG ، به ترتیب 21/1 و U(mmol/min) / ml 07/0 به دست آمد و در نهایت نشان داده شد که میزان بیان پروتئین cel6B به علت پایین بودن شاخص CAI (انطباق کدونی) و تفاوت کدون های مورد ترجیح E. coli، پایین است. همچنین با بررسی توالی سیگنال بومی این ژن در سرویس دهنده Signal P4.1 عدم قابلیت ترشح این پروتئین در E. coli اثبات شد.