بیان و تخلیص آنزیم Cas9 در باکتری E. coli

ویرایش ژنوم مبتنی بر فناوری CRISPR/Cas9 (کریسپر) به عنوان ابزار قدرتمندی برای اصلاح گیاهان زراعی بسرعت در حال گسترش است. یکی از مزایای این فناوری امکان دستورزی ژن های هدف بدون درج DNA خارجی در گیاه است. برای این منظور نیاز است که آنزیم Cas9 و RNA  راهنما بصورت کمپلکس پروتیین-RNA (RNP) به سلول گیاهی منتقل شود. از اینرو تولید Cas9 در آزمایشگاه مقدمه آزمایشات کریسپر مبتنی بر RNP است.هدف این پروژه بیان و تخلیص آنزیم Cas9 در باکتری E. coli می باشد. در این پژوهش ژن Cas9 در ناقل بیانی pBADM30 کلون و به باکتری  E. coliسویه ی CodonPlus منتقل شد. بیان Cas9 با اعمال 2/0 درصد L-Arabinose  القا شد و سپس از کل پروتیین محلول جداسازی شد. سپس آنزیم Cas9 توسط با استفاده از ستون میل ترکیبی نیکل تخلیص شد. حضور Cas9  در پروتیین کل و پروتیین تخلیص شده با استفاده از الکتروفورز SDS-PAGE تایید شد. نتایج حاصل از کلونی PCR و هضم دوگانه ی آنزیمی وجود ژن Cas9 در ناقل pBADM30 را تایید نمود. نتایج  SDS-PAGE حضور پروتیین با وزن ملکولی حدود 180 kDa را در پروتیین کل نشان داد. همچنین وجود یک تک باند با وزن ملکولی حدود 180 kDa در دو فرگشن بافر شستشو ی حاصل ار رزین نیکل نشان داد که پروتیین هدف به درستی تخلیص شده است. آنزیم Cas9 در باکتری  E.coli  با موفقیت بیان و تخلیص شد. با توجه به نتایج به دست آمده می توان  گفت که پس از سنجش فعالیت کاتالیکی آنزیم Cas9 می توان از این آنزیم به همراه  RNA راهنما و ساخت کمپلکس RNP و انتقال آن به گیاه با روش پروتوپلاست یا الکتروپوریشن در پژوهش های بعدی استفاده کرد