کلونینگ، بیان دهنده سم بوتولینوم تیپ A و تخلیص ژن بخش انتقال

سم بوتولینوم تیپ A به لحاظ ساختاری از یک زنجیره سبک به وزن KD50 و یک زنجیره سنگین به وزن KD100 تشکیل شده است که به وسیله یک باند دی سولفید به متصل شده اند. این پروتئین شامل سه بخش عملکردی است. بخش آنزیمی با فعالیت کاتایتیک که همان زنجیره سبک می باشد. بخش انتقال دهنده که نیمه انتهای آمینی زنجیره سنگین است و بخش اتصال دهنده که نیمه انتهای کربوکسیل زنجیره سنگین را تشکیل می دهد. در این پژوهش، هدف از تولید نوترکیب بخش انتقال دهنده سم بوتولینوم تیپ A، مطالعه کارایی این بخش از سم به طور مستقل یا همراه با بخش اتصال دهنده توکیسن به منظور دستیابی به یک پروتئین ایمنی زا در تحقیقات بعدی بوده است. از طرف دیگر تولید انبوه این بخش از سم، مطالعه ساختار و مکانیزم دقیق بخش انتقال دهنده را همراه خواهد ساخت. باکتری در شرایط بی هوازی رشد داده شد سپس DNA کروموزومی به روش قلیایی استخراج گردید. پس از بررسی ترادف ژن مربوطه و طراحی پرایمر، قطعه مورد نظر از طریق واکنش های زنجیره ای پلیمرازی (PCR) فراوان سازی شد. محصول PCR به وسیله آنالیز آنزیمی ارزیابی شد و بر روی سه ناقل مختلف بیانی pRSET A، a28pET و a32pET همسانه سازی گردید. پروتئین تولید شده به وسیله SDS-PAGE بررسی شد و صحبت محصول با روش وسترن بالتینگ و واکنش الیزا مورد تایید نهایی قرار گفت و سپس به وسیله کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص سازی شد. بحث و در این تحقیق بالاترین بیان در شرایط غلظت 5/0 میلی مولار IPTG، جذب نوری 6/0 و زمان القا 15 ساعت در دمای C30 به دست آمد. هر چند بیان ژن هایی که درصد بالایی از AT را برخوردارند در سیستم E-coil ضعیف است اما با این حال بیان مناسبی از این ژن به دست آمد. تخلیص پروتئین نوترکیب در مراحل اولیه به دلیل اتصال ضعیف نشان هیستیدین به ستون دشوار بود که ما با تغییر در روش ها توانستیم این پروتئین را تا 90% خالص سازی کنیم.