کلونینگ و بررسی بیان ژن hcpD هلیکوباکتر پیلوری

ژن hcpD به عنوان یکی از ژن های کد کننده خانواده پروتئین های غنی از سیستئین هلیکوباکتر پیلوری است. این دسته از پروتئینها سبب تحریک سیستم ایمنی میزبان و تولید آنتی بادی میگردند. هلیکوباکتر پیلوری مستقر در معده انسان سبب بیماری های گوارشی نظیر: زخم دوازدهه، گاستریت مزمن و سرطان معده میشود. هدف از این مطالعه، تکثیر، جداسازی و همسانه سازی ژن hcpD هلیکوباکتر پیلوری در وکتور pcDNA3.1(-) و بررسی بیان آن در سیستم یوکاریوتی است.
در این مطالعه تجربی، DNA ژنومی از هلیکوباکتر پیلوری با استفاده از کیت استخراج DNA تخلیص شد. سپس ژن hcpD به روش PCR تکثیر و ژن مورد نظر پس از خالص سازی از روی ژل، در وکتور pTZ کلون گردید. ساب کلونینگ ژن hcpD در وکتور بیانی یوکاریوتی pcDNA3.1(-) انجام شد. صحت مراحل کلون سازی به ترتیب با سه روش PCR، هضم آنزیمی با آنزیم های BamHI و EcoRV و نهایتا تعیین توالی مورد بررسی قرار گرفت. سازه بیانی ساخته شده توسط منفذزایی الکتریکی به سلولهای CHO منتقل شد. بیان ژن در سلولهای CHO با تکنیکهای RT-PCR و SDS-PAGE آنالیز شد.
نتایج PCR نشان دهنده تکثیر قطعه 933 جفت بازی مربوط به ژن hcpD بود. کلونسازی این ژن در وکتور pTZ، با موفقیت انجام شد و پلاسمید نوترکیب pTZ-hcpD بدست آمد. هضم آنزیمی و تعیین توالی، موید درستی ساب کلونینگ ژن و ایجاد سازواره نهایی pcDNA3.1(-)-hcpD است. بیان ژن hcpD در سیستم یوکاریوتی انجام و محصول پروتئینی این ژن روی ژل SDS-PAGE مشاهده شد.
سازواره pTZ-hcpD به عنوان منبعی از ژن chpD هلیکوباکتر پیلوری برای تحقیقات آینده نظیر تولید پروتئین نوترکیب و ایجاد واکسن نوترکیب در سیستم های مختلف میباشد. از طرف دیگر، بیان موفق ژن hcpD با کمک وکتور نوترکیب pcDNA3.1(-)-hcpD در سلولهای جانوری CHO، نشان‫دهنده پتانسیل این وکتور به عنوان واکسن نوترکیب علیه هلیکوباکتر پیلوری می باشد.