کلون کردن DNA و بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی

شناخت ساختار و عملکرد پروتئین آلفا- سینوکلئین می تواند زمینه ساز توسعه روش های درمانی مناسب علیه بیماری پارکینسون باشد. هدف پژوهش حاضر، کلون کردن DNA و بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی بود. در پژوهش تجربی حاضر، توالی کدکننده آلفا- سینوکلئین موجود در پلازمید نوترکیب pRK172، به کمک روش PCR و با استفاده از پرایمرهای مناسب تکثیر شد. DNA سنتزشده توسط آنزیم های محدودگر SalI وHindIII بریده و در حامل pET28a کلون و پلازمید نوترکیب به روش کلسیم کلراید به سویه بیانی باکتری اشریشیاکلی (BL21) منتقل شد. بیان آلفا-سینوکلئین توسط محلول IPTG القا و بیان پروتئین نوترکیب با روش الکتروفورز SDS-PAGE ارزیابی شد. ردیف سازی توالی ها به کمک الگوریتم ClustalW با برنامه BioEdit 5.0.9 صورت پذیرفت. در محصولات واکنش های برش آنزیمی DNA و پلازمید pET28a با آنزیم های محدودگر، اندازه قطعات، نشان دهنده صحت واکنش های آنزیمی بود. DNA تکثیرشده و پلازمید pET28a مورد استفاده به ترتیب با طول های 407 و 5369 نوکلئوتید بودند. ترجمه حاصل از توالی قطعه کلون شده، تشابه 100% با پروتئین آلفا- سینوکلئین انسانی را نشان داد. در بیان پروتئین نوترکیب در قیاس با نمونه های شاهد منفی، افزودن IPTG موجب افزایش بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در تمامی نمونه ها به ویژه 2 ساعت پس از القا شد. بیشتر آلفا- سینوکلئین بیان شده از پلازمید pET28a-alpha-Synuclein به صورت اجسام گنجانده در باکتری تجمع یافتند. پروتئین آلفا- سینوکلئین در پلازمید pET28a کلون و تشکیل اجسام گنجانده توسط آلفا- سینوکلئین به هنگام بیان از سامانه pET28a-alpha-Synuclein تایید می شود و راه را بر تولید این پروتئین در مقیاس بالا هموار می سازد.