کلونینگ، بیان ژن، خالص سازی و تعیین خصوصیات آنزیم الاستاز حاصل از باکتری سودوموناس آئروجینوزا

الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا یک آنزیم مهم در زمینه مطالعات بنیادی بر روی Zn-متالوپروتئازها و نیز بعنوان فاکتور ویرولانس این باکتری مطرح است. در این مطالعه ژن مربوط به آنزیم الاستاز از سودوموناس آئروجینوزا (PAE) استخراج و کلون شده و پس از بیان و تخلیص، خصوصیات بیوشیمیایی آن شامل دما و pH بهینه و نیز فعالیت در حور حلالهای آلی گلیسرول، دی متیل فرمامید (DMF)، متانول، اتانول، اتیلن گلایکول و ایزوپروپانول مورد مطالعه قرار گرفت.
تایید گونه باکتری با تستهای بیوشیمیایی شامل سیترات، SIM، MR-VP و TSI انجام شد. DNA ژنومی توسط کیت استخراج و با پرایمر اختصاصی بوسیله PCR ژن الاستاز بدست آمد. کلونینگ در وکتور pET21a(+) با مکان های برش HindIII و NdeI صورت گرفت. ترانسفورماسیون به روش شیمیایی انجام شد. سپس سلول ها در محیط LB تحت القای IPTG 1mM قرار گرفته و زمان و شرایط تولید بهینه گردید.
بدنبال تایید گونه باکتریایی توسط تستهای بیوشیمیایی، DNA ژنومی استخراج شد و سپس ژن PAE به کمک پرایمر اختصاصی توسط PCR جدا شد. ژن الاستاز که بصورت پری پرو الاستاز کد می شود، درون وکتور) pET21a(+ کلون و در باکتری E. coli سویه BL21 ترانسفورم گردید. آنالیز سکانس نوکلئوتیدی ژن یک چارچوب خوانش (ORF) دارای 1497 جفت باز که 497 آمینواسید را کد می کند نشان داد. بدنبال القاء به کمک IPTG آنزیم فعال در درون سلول یافت شد. سپس آنزیم توسط کروماتوگرافی تمایلی تخلیص گردید. بررسی خصوصیات آنزیم از قبیل دمای بهینه، pH بهینه و غیر فعال سازی حرارتی برگشت ناپذیرانجام شد و همچنین فعالیت آنزیم در حضور حلالهای آلی بررسی گردید و بخوبی نشان داده شد که آنزیم مذکور از مقاومت و فعالیت بسیار بالایی در حلالهای آلی برخوردار است.
آنزیم الاستاز سویه PTCC 1430 در مقایسه با آنزیم سویه PAO1، که ساختار کریستالی آن تعیین شده، تنها یک تغییر در ناحیه سیگنال را نشان می دهد. خصوصیات بیوشیمیایی نشان می دهد که الاستاز یک آنزیم با پایداری زیاد در حلال های آلی است.