ردیابی اختصاصی Phytopthora inundata از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز ساده و تودرتو

گونه Phytophthora inundataبه تازگی توصیف شده و به علت خصوصیات ریخت شناختی و حداکثر دمای رشد غیرعادی، شناسایی آن دشوار است. این گونه با سایر گونه های بیمارگر گیاهی جنس Phytophthora که بدون پاپیل و گرماپسند هستند، اشتباه می شود. در این بررسی برای شناسایی P. inundata شیوه ای براساس واکنش زنجیره ای پلیمراز ساده و تودرتو ابداع شد. بدین منظور مجموعه ای از جدایه ها مربوط به میزبان های مختلف که نماینده تنوع موجود در توالی نواحی رمزگذار و فاقد رمز این گونه بودند، مورد بررسی قرار گرفت. براساس توالی های جداکننده نسخه برداری شده داخلی یک و دو و ژن 8/5 اس مربوط به دی ان ای ریبوزومی (آی تی اس)، ژن پروتئین مقاوم به شوک حرارتی 90، ژن های پروتئین پیوسته تریوزفسفات ایزومراز/گلیسرآلدئید سه فسفات دی هیدروژناز و هم چنین ژن پروتئین 60 اس ریبوزومی ال 10، برای گونه مذکور ده عدد آغازگر واکنش زنجیره ای پلیمراز اختصاصی طراحی گردید. برای ایجاد بیشترین اختصاصیت و کارآیی، دمای جفت شدگی و زمان گسترش برای هر جفت آغازگر بهینه سازی گردید. برای ارزیابی آغازگرها از 28 گونه دیگر فیتوفتورا که از نظر ریخت شناختی و مولکولی تایید شده بودند، استفاده شد. در اغلب موارد هیچ یک از مجموعه آغازگرها قادر به فزون سازی دی ان ای خالص سازی شده از گونه های Phytophthora غیرخودی نبودند. واکاوی-ها نشان داد که بهترین نامزد برای شناسایی جدایه های P. inundata مجموعه ITS-I1 می باشد که از ترکیب آغازگرهای ITS-IF1 و ITS-IF2 تشکیل شده است. دمای جفت شدگی بهینه برای این مجموعه 69 درجه سانتی گراد و بهترین زمان گسترش 40 ثانیه می-باشد. به نظر می رسد استفاده از واکنش زنجیره ای تودرتو با استفاده از مجموعه ITS-I1 به همراه آغازگرهای عمومی ITS4 و ITS6 به عنوان آغازگرهای خارجی حداقل 50 برابر حساس تر از روش سنتی است.