طراحی و ساخت کاست ژنی ctxB-gfp-stxBو بررسی بیان آن در E. coli سویه (Bl21 (DE3

پروتئین های نوترکیب کایمریک، به منظور افزایش بیان پروتئین های محلول، تسهیل در تخلیص آن ها و تولید پلی پپتید چند منظوره، ابداع شده اند. هدف از این تحقیق، ساخت کاست ژنی ctxB -gfp-stxB و بررسی بیان آن به منظور بررسی میزان جذب و دفع آنتی ژن الحاقی در مطالعات بعدی می باشد.
پس از تهیه پرایمر های مورد نیاز برای ژن های gfp به عنوان ژن گزارشگر، ctxB و stxB، از تکنیک PCR برای تکثیر ژن ها استفاده شد. ژن های تکثیر شده، در وکتور pGEM، همسانه سازی و پس از تایید قطعات ژنی به ترتیب ctxB –gfp-stxB به یکدیگر ممزوج شدند. سپس، کاست ژنی ساخته شده، در وکتور بیانی pET28a(+) هم سانه سازی شد. باکتری E. coli سویه (DE3 (Bl21، توسط وکتور نوترکیب، ترانسفورم شد و بیان پروتئین، تحت القای IPTG و الکتروفورز SDS-PAGE ارزیابی شد.
ژن های تکثیر شده در وکتور pGEM، همسانه سازی شدند و کلون ها به کمک سه روش PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی، تایید شدند. قطعات ژنی تایید شده به ترتیب ctxB -gfp-stxB به یکدیگر ممزوج شد. پس از زیرهمسانه سازی، وجود کاست ژنی ساخته شده به روش هضم آنزیمی تایید شد. برای این کاست ژنی، در E. Coli سویه Bl21(DE3)، بیانی مشاهده نشد.
تعداد زیاد کدون های نادر در ژن های stxB و ctxB، باعث عدم بیان کاست ژنی در E. coli شد. بنابراین، برای دستیابی به بیان و بهینه سازی آن، یافتن میزبانی مناسب، ضروری است. با توجه به ساختار کاست ژنی و جایگاه آنزیم های محدودالاثر بر روی قطعه ساخته شده، ژن های مختلف را می توان جایگزین نموده و قطعات متنوع ژنی تولید نمود.