بهینه سازی بیان، تخلیص و بررسی خاصیت ضد میکروبی پروتئین نوترکیب بتا دیفنسین 2 نوتروفیل‎های گاو

دیفنسین‎ها یکی از بزرگ‎ترین خانواده‎ی پپتید‎های ضد میکروب می‎باشند که به واسطه‎ی فعالیت بر علیه باکتری ها، قارچ‎ها و بسیاری از ویروس‎ها به عنوان آنتی‎بیوتیک‎های نسل جدید منفعت بسیاری دارند. هدف از این مطالعه بهینه سازی بیان، تخلیص و بررسی خاصیت ضد میکروبی پروتئین بتا دیفنسین 2 نوتروفیل‎های گاو (BNBD2) بوده است.

در این مطالعه‎ی تجربی-آزمایشگاهی باکتری اشرشیاکلی B L21(DE3) حامل وکتور pET-32a(+) که ژن BNBD2 در آن همسانه سازی شده بود جهت مطالعات مورد استفاده قرار گرفت. بیان پروتئین BNBD2 با تغییر در پارامترهای دانسیته‎ی سلولی، دمای رشد، مدت زمان القاء با استفاده از سیستم الکتروفورز عمودی (SDS-PAGE) و تست برادفورد به صورت کمی و کیفی بررسی گردید. مراحل تخلیص پروتئین نوترکیب با کمک روش شیمیایی شکافت در جایگاه فرمیک اسید و عبور از سانتریکون و اثر ضد باکتری پروتئین تخلیص شده بر چند نمونه‎ی باکتریایی گرم مثبت و گرم منفی مورد بررسی قرار گرفت.

با استفاده از محیط کشت Luria–Bertani، شروع القاء در جذب نوری 8/0 در طول موج 600 نانومتر، غلظت یک میلی مولار ماده‎ی القاء کننده‎ی IPTG، دمای رشد 30 درجه و مدت زمان 4 ساعت پس از القاء بیشترین میزان بیان پروتئین به دست آمد. پروتئین نوترکیب با استفاده از شکافت در جایگاه فرمیک اسید و عبور از سانتریکون تخلیص گردید. نتایج آزمایش وسترن بلاتینگ نیز نشان داد که پروتئین نوترکیب به طور اختصاصی به آنتی‎بادی mouse anti-(His)6 peroxidase متصل می‎گردد. تشکیل هاله‎ی عدم رشد در محیط‎های کشت مولر هینتون آگار حاوی کشت سطحی باکتری های مورد آزمایش خاصیت ضد باکتری این پروتئین را نشان داد.

با توجه به خاصیت ضد میکروبی پروتئین BNBD2و امکان بیان پروتئین در باکتری E. coli می توان به تولید انبوه این پروتئین نوترکیب اقدام نمود.