مقایسه ی تعداد نسخه های درج شده ی ژن 10-IP با استفاده از سیستم تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی بر اساس سیستم ترانسپوزونی PiggyBac در ژنوم سلول های Human embryonic kidney

یکی از چالش های پیش رو در روش های مرسوم تولید پروتئین نوترکیب که ترانسژن به صورت خطی به سلول میزبان وارد می شود، هتروژنی در تعداد نسخه های ترانسژن در کلون های مختلف به دست آمده است که منجر به بیان ژن در سطوح مختلف می شود. گذشته از کارایی پایین درج خطی در ژنوم میزبان، پدیده ای دیگر به نام Position effect باعث کمتر شدن کارایی بیان ژن می گردد. PiggyBac کلاسی از DNA ترانسپوزونی است که می تواند به صورت مکانیزم Cut and paste در ژنوم سلول میزبان جابه جا شود. برخی خصوصیات منحصر به فرد این ترانسپوزون، آن را به یکی از وکتور های مناسب در مطالعات انتقال ژن تبدیل کرده است. انتقال ترانسژن با حجم بالا و درج در نواحی فعال از نظر رونویسی، از جمله خصوصیات مهم این ترانسپوزون است که می توان از آن در تولید پروتئین نوترکیب با کارایی بالا بهره برد. در این تحقیق، تعداد نسخه های درجی در کلون های به دست آمده از سیستم تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی این سیستم در رده ی سلولی HEK (Human embryonic kidney) مقایسه شده است.

تولید سازه های تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی سیستم ترانسپوزاز حاوی ژن 10-IP و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک هیگرومایسین با استفاده از روش های کلونینگ مولکولی به انجام رسید. رده ی سلولی HEK پس از تکثیر در پلیت های سلولی جهت انجام ترانسفکشن Seed شدند. سازه ها با استفاده از کیت لیپوفکتامین 2000 ترانسفکت شدند و پس از 48 ساعت مورد تیمار با آنتی بیوتیک هیگرومایسین به مدت دو هفته قرار گرفتند. کلون های به دست آمده پس از استخراج DNA ژنومی با تکنیک Absolute real-time PCR (Absolute real-time polymerase chain reaction) از نظر تعداد نسخه های ژنی درج شده مورد بررسی قرار گرفتند.

تعداد نسخه های ژنی به دست آمده با استفاده از سیستم تک پلاسمیدی در هر سلول، برابر با 5 نسخه بود؛ در حالی که این عدد در سیستم دو پلاسمیدی برابر با دو نسخه بود.

بررسی نتایج حاصل از تعداد نسخه های درجی در سیتم های تک پلاسمیدی و دو پلاسمیدی نشان داد که سیستم تک پلاسمیدی کارایی بالاتری از لحاظ تعداد نسخه های درجی دارد و می توان با کلون کردن ژن مورد نظر و کاست بیان کننده ی آنزیم ترانسپوزاز در یک پلاسمید واحد، تعداد نسخ بیشتری جهت بیان بیشتر پروتئین نوترکیب به دست آورد.