کلونینگ ژن lipL41 با هدف تولید کنترل مثبت جهت تشخیص لپتوسپیراهای بیماریزا

لپتوسپیروزیس، یکی از شایع ترین بیماری های مشترک بین انسان و حیوان با انتشار جهانی می باشد. مشخص شده که LipL41 یک پروتئین غشای خارجی ایمونوژنیک می باشد که در لپتوسپیرا های بیماریزا وجود دارد و می تواند در روش های تشخیص سرولوژیکی و همچنین به عنوان یک کاندیدای مناسب در تهیه واکسن های نوترکیب به کار برده شود. هدف از این تحقیق بهره گیری از خصوصیات ژن lipL41 به منظور طراحی یک کنترل مثبت در افتراق سرووارهای بیماریزای لپتوسپیرا از غیربیماریزا با استفاده از PCR می باشد. در این تحقیق از پنج سرووار بیماریزای لپتوسپیرا و یک سرووار غیر بیماریزا استفاده گردید. باکتری ها در محیط کشت اختصاصی (EMJH) کشت داده شدند و DNA ژنومیک آن ها تخلیص گردید. ژن lipL41 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد. جهت انجام کلونینگ ژن مورد نظر، محصول PCR، خالص سازی شده و در وکتور pTZ57R/T الحاق گردید و در باکتری اشریشیا کلی (Top10) کلون گردید. تایید حضور lipL41 در کلنی های نوترکیب با برداشت از کلنی های رشد یافته روی پلیت LB آگار حاوی آمپی سیلین و انجام PCR و تکثیر ژن مورد نظر انجام شد. تخلیص DNA نوترکیب توسط کیت انجام گرفت. سپس پلاسمید حاوی ژن مورد نظر تعیین ترادف شد. محصول PCR به دست آمده یک قطعه bp 1065 را نشان می داد که نشان دهنده تکثیر ژن lipL41 بود این ژن فقط در سرووارهای بیماریزا حضور دارد در صورتی که در سرووار غیر بیماریزای لپتوسپیرا بایفلکسا مشاهده نگردید. تخلیص کلونی های مثبت وکتور پلاسمیدی به وسیله کیت صورت گرفت. واکنش PCR برای DNA نمونه به همراه کنترل مثبت در دو تیوب جداگانه انجام شد. محصول PCR مربوط به نمونه و کنترل مثبت با ژل الکتروفورز و سایز مارکر مقایسه و مورد تایید قرار گرفت. به علت کند رشد بودن لپتوسپیرا و شرایط خاص نگهداری و عدم دسترسی همگان به سوش های رفرانس، استفاده از یک تست سریع و دقیق مولکولی مانند PCR به همراه یک کنترل مثبت به منظور تایید صحت آن ضروری می باشد. بنابراین می توان از ژن کلون شده در این تحقیق که در آزمایشگاه تشخیصی لپتوسپیرا آماده شده است، به عنوان کنترل مثبت در آزمایش PCR در تمام آزمایشگاه ها استفاده کرد.