اولین گزارش از Diplodia seriata عامل بیماری شانکر و خشکیدگی شاخه های درختان سیب در ایران

طی مطالعه روی عوامل بیماریزای شاخه و تنه درختان سیب در باغ های زیر کشت این محصول در شهرستان ارومیه، از درختان سیب رقم گلدن با سن بالای 15 سال و با نشانه های شانکر در بخش تنه و شاخه ها، خشکیدگی شاخه ها، پوسته پوسته شدن سطح شاخه ها و نیز قهوه ای شدن پوست در بخش های آلوده (شکل 1-A)، جدایه هایی پیکنیدیوم دار به دست آمد.خالص سازی جدایه های رشد کرده به روش کشت نوک ریسه انجام گرفت. برای القای تشکیل اندام های باردهی ابتدا جدایه های خالص شده در تشتک های پتری حاوی محیط کشت آب آگار 2 درصد کشت شدند. سپس سوزن های سترون شده کاج در چند محل در سطح محیط کشت قرار داده شدند وتشتک های پتری به مدت 4 هفته در دمای 25 درجه سلسیوس و در زیر نور نزدیک ماورا بنفش (near-UV) و با دوره نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. بعد از گذشت این مدت، پیکنیدیوم ها به فراوانی روی سوزن های کاج تشکیل شدند (Pavlic et al. 2008).
برای شناسایی، معیارهای مختلف ماکروسکوپی مانند رنگ و خصوصیات ظاهری رشدی پرگنه و مشخصات میکروسکوپی مانند رنگ، شکل و ابعاد هاگ، یاخته های هاگ زا و پیکنیدیوم مورد مطالعه قرار گرفتند. برای تکمیل شناسایی مورفولوژیک،بخش ITS در یکی از جدایه های منتخب، با استفاده از آغازگر های ITS1 و NL-4 تکثیر و ترادف یابی گردید. بر اساس مطالعات ریخت شناختی و ترادف یابی بخش ITS، گونه Diplodia seriata De Not.شناسایی گردید (Phillips et al. 2007). جستجوی بلاست توالی به دست آمده با توالی های موجود در بانک ژن (NCBI) شباهت 100 درصدی آن را با توالی های متعلق به گونه D. seriata، تایید نمود. مشخصات توصیفی گونه به این شرح است: میانگین قطر رشد پرگنه در جدایه ها بعد از گذشت 3 روز برابر 80-75 میلی متر بود. بافت پرگنه در ابتدا سفید رنگ، ولی بعد از گذشت سه روز از بخش میانی به رنگ زیتونی متمایل به سبز تا زیتونی خاکستری تغییر یافته و در نهایت بعد از گذشت دو هفته کاملا سیاه رنگ شد. پرگنه دارای حاشیه منظم و با ریسه های هوایی متراکم و فشرده روی محیط کشت بود. کنیدیوماها به صورت پیکنیدیوم، گرد تا بیضی شکل، به قطر تقریبی 380 × 260 میکرومتر، به طور منفرد یا در دسته های چندتایی، به رنگ قهوه ای تیره تا سیاه و فرورفته در بافت تشکیل شده و در شکل[H1] 1. نشانه های شانکر و خشکیدگی شاخه درختان سیب رقم گلدن در باغ های ارومیه (A)، برش طولی پیکنیدیوم (B) و هاگ های (C) گونه Diplodia seriata و آزمون اثبات بیماری زایی گونه Diplodia seriataروی نهال ها (D) و میوه (E) سیب رقم گلدن.
Fig. 1. Canker symptoms on stems of apple Golden cultivar in Urmia orchards (A)، Longitudinal section of pycnidium (B) and conidia (C) of Diplodia seriata and Pathogenicity tests of Diplodia seriata on seedlings (D) and fruits (E) of apple Golden cultivar.
هنگام بلوغ کمی شکوفا است (شکل 1-B). یاخته های هاگ زا بی رنگ، صاف، استوانه ای شکل، در قسمت پایه متورم و به ابعاد 12-7 × 5-3 میکرومتر بودند. هاگ زایی در یک سطح با قطور شدگی حاشیه ای (Periclinal) و یا به صورت پی رست[H2] (Percurrent) و دارای 2 یا 3 حلقه بود. هاگ ها با دیواره ضخیم، با سطح بیرونی صاف، سطح درونی زگیل دار و کاملا مشخص، بیضی تا استوانه ای شکل، با انتهای گرد و در قسمت پایه به طور مشخص تخت و بریده و به ندرت گرد بودند. هاگ ها ابتدا بی رنگ و تک یاخته بوده و سپس قبل از خارج شدن از پیکنیدیوم با تشکیل یک بند عرضی، دو یاخته ای می شدند و رنگ آنها به قهوه ای روشن تا قهوه ای تیره تغییر یافت(شکل 1-C). در برخی موارد، هاگ ها بعد از خروج از پیکنیدیوم دارای 2 یا 3 بند عرضی بودند. ابعاد هاگ ها (31-) 02/22- 6/20 (-12) × (12-) 05/10- 6/9 (- 5/7) میکرومتر و نسبت طول/عرض هاگ برابر 2/2 بود.اثبات بیماری زایی جدایه ها، با مایه زنی آنها روی نهال های دو ساله و نیز میوه سیب رقم گلدن در قالب طرح کاملا تصادفی به همراه تیمار شاهد انجام گرفت. بعد از گذشت 8 هفته، تمام نهال های مایه زنی شده نشانه های شانکر و خشک شدن پوست در اطراف محل مایه زنی را نشان دادند (شکل 1-D)، در آزمون بیماری زایی روی میوه ها، مشخص شد که بعد از گذشت 6 روز، در اطراف محل مایه زنی، نشانه ها به صورت پوسیدگی قهوه ای تیره با حاشیه کاملا مشخص و متمایز از بافت سالم ایجاد شد (شکل1-E) و در برش عمودی از بافت میوه در محل مایه زنی، پیشرفت پوسیدگی به داخل بافت گوشت میوه به طور مشخصی مشاهده شد. جداسازی قارچ از نهال ها و میوه های مایه زنی شده مجددا انجام گرفت. بر اساس بررسی منابع و اطلاعات موجود، این اولین گزارش از وجود و تعیین بیماری زایی گونه D. seriata مرتبط با شانکر درختان سیب در ایران است.