طراحی و ساخت کانسترکت نوترکیب واجد ژن اینترفرون بتای جهش یافته در ناحیه کزاک (Kozak) به منظور تشدید ترجمه

اینترفرون بتا یکی از مهمترین اعضای گروه I اینترفرون ها بوده و به عنوان داروی اصلی در بسیاری از بیماری ها از جمله بیماری مالتیپل اسکلروزیس استفاده می شود. پروتئین اینترفرون بتا واجد نیمه ی عمر کمی بوده و لذا بیماران به دریافت مکرر دارو نیازمند می باشند. با توجه به اهمیت دارویی پروتئین اینترفرون بتا، امروزه تلاش های گسترده ای در جهت بهبود سطح ترجمه و افزایش تولید آن صورت پذیرفته است. چندین عامل مهم می تواند بر روی میزان بیان پروتئین در سلول تاثیر گذار باشند که توالی مناسب احاطه کننده کدون آغاز (توالی کزاک) از جمله ی آن موارد می باشد.
پرایمرهای اختصاصی جهت ایجاد جهش هدفمند در توالی کزاک با استفاده از روش SOEing PCR (Splicing by overlap extension / Splicing by overhang extension (SOE) PCR) طراحی و PCR انجام شد. به منظور ایجاد جهش مورد نظر در ژن اینترفرون بتا سه واکنش PCR انجام پذیرفت. محصول نهایی جهش یافته و پلاسمید pSVM، برش داده شده و متعاقبا اتصال بین محصولات برش داده شده توسط لیگاز انجام گرفت. پس از ترانسفورماسیون با استفاده از مخلوط لایگیشن، استخراج پلاسمید صورت گرفت. پس از تولید کانسترکت و تایید با استفاده از روش های هضم آنزیمی و PCR کانسترکت نوترکیب به رده ی سلولی CHO با استفاده از کیت لیپوفکتامین ترانسفکت گردید.
در تحقیق حاضر با استفاده از روش های مهندسی ژنتیک کانسترکت نوترکیب اینترفرون بتا تولید گردید. در این کانسترکت با استفاده از روش SOEing PCR و ایجاد جهش های هدفمند در ناحیه ی توالی کزاک، توالی مذکور به حالت ثابت نزدیک گردید. کلنی های سفید رنگ بر روی محیط کشت پس از ترانسفورماسیون مشاهده گردید. استخراج پلاسمید از کلنی ها انجام گرفته و صحت کانسترکت نوترکیب با استفاده از هضم آنزیم و همچنین PCR تایید گردید. طول قطعه ی ایجاد شده پس از هضم آنزیمی صحت کلون نمودن ژن نوترکیب اینترفرون بتا را تایید نمود. پس از تایید فرایند کلونینگ، سلول های CHO کشت داده شده و ترانسفکشن پلاسمید نوترکیب به رده ی سلولی CHO صورت گرفت.
جهش هدفمند در توالی کزاک ژن اینترفرون بتا صورت گرفت. جهش مورد نظر بر روی توالی کزاک می تواند سبب بهبود و افزایش میزان ترجمه پروتئین اینترفرون بتا گردد. در مراحل بعدی میزان تاثیر جهش در روند تولید پروتئین با استفاده از روش ELISAبررسی خواهد شد.