Chimeric External Control to Quantify Cell Free DNA in Plasma Samples by Real Time PCR
Message:
Abstract:
Background
DNA isolation procedure can significantly influence the quantification of DNA by real time PCR specially when cell free DNA (cfDNA) is the subject. To assess the extraction efficiency, linearity of the extraction yield, presence of co-purified inhibitors and to avoid problems with fragment size relevant to cfDNA, development of appropriate External DNA Control (EDC) is challenging. Using non-human chimeric nucleotide sequences, an EDC was developed for standardization of qPCR for monitoring stability of cfDNA concentration in blood samples over time.
Methods
A DNA fragment of 167 bp chimeric sequence of parvovirus B19 and pBHA designated as EDC fragment was designed. To determine the impact of different factors during DNA extraction processing on quantification of cfDNA, blood samples were collected from normal subjects and divided into aliquots with and without specific treatment. In time intervals, the plasma samples were isolated. The amplicon of 167 bp EDC fragment in final concentration of 1.1 pg/ 500 μl was added to each plasma sample and total DNA was extracted by an in house method. Relative and absolute quantification real time PCR was performed to quantify both EDC fragment and cfDNA in extracted samples.
Results
Comparison of real time PCR threshold cycle (Ct) for cfDNA fragment in tubes with and without specific treatment indicated a decrease in untreated tubes. In contrast, the threshold cycle was constant for EDC fragment in treated and untreated tubes, indicating the difference in Ct values of the cfDNA is because of specific treatments that were made on them.
Conclusions
Spiking of DNA fragment size relevant to cfDNA into the plasma sample can be useful to minimize the bias due to sample preparation and extraction processing. Therefore, it is highly recommended that standard external DNA control be employed for the extraction and quantification of cfDNA for accurate data analysis.
Language:
English
Published:
Avicenna Journal of Medical Biotechnology, Volume:8 Issue: 2, 2016
Page:
84
magiran.com/p1519971  
برخی از خدمات از جمله دانلود متن مقالات تنها به مشترکان مگیران ارایه می‌گردد. شما می‌توانید به یکی از روش‌های زیر مشترک شوید:
اشتراک شخصی
در سایت عضو شوید و هزینه اشتراک یک‌ساله سایت به مبلغ 400,000ريال را پرداخت کنید. همزمان با برقراری دوره اشتراک بسته دانلود 100 مطلب نیز برای شما فعال خواهد شد!
پرداخت با کارتهای اعتباری بین المللی از طریق PayPal امکانپذیر است.
اشتراک سازمانی
به کتابخانه دانشگاه یا محل کار خود پیشنهاد کنید تا اشتراک سازمانی این پایگاه را برای دسترسی همه کاربران به متن مطالب خریداری نمایند!
توجه!
  • دسترسی به متن مقالات این پایگاه در قالب ارایه خدمات کتابخانه دیجیتال و با دریافت حق عضویت صورت می‌گیرد و مگیران بهایی برای هر مقاله تعیین نکرده و وجهی بابت آن دریافت نمی‌کند.
  • حق عضویت دریافتی صرف حمایت از نشریات عضو و نگهداری، تکمیل و توسعه مگیران می‌شود.
  • پرداخت حق اشتراک و دانلود مقالات اجازه بازنشر آن در سایر رسانه‌های چاپی و دیجیتال را به کاربر نمی‌دهد.