بررسی ارتباط جهش در اگزون های 30 و 33 ژن MYBPC3 با بیماران کاردیومیوپاتی هایپرتروفی به روش PCR-SSCP/HA در استان چهارمحال و بختیاری

کاردیومیوپاتی هایپرتروفی (HCM)، رایج ترین بیماری ارثی مربوط به عضله قلب می باشد که در صورت درگیری ماهیچه بطن چپ قلب، به طور غیر طبیعی رشد کرده و ضخیم می شود (1). بر این اساس، حفره بطن چپ کوچک شده و با وجود حفظ قدرت انقباضی، قدرت انبساط حفره و پذیرش خون کم می شود. به دلیل حفظ قدرت انقباضی در اوایل بیماری، علائم نارسایی قلب کمتر دیده می شود، ولی در موارد پیشرفته موجب کاهش برون ده قلبی و بروز علائم نارسایی قلب می شود. دامنه آن از فقدان علائم بیماری در تمام عمر تا پیشرفت سریع نارسایی قلبی یا مرگ قلبی ناگهانی در ابتدا و گاهی اوقات با کمی و یا حتی بدون هایپرتروفی است (2،3). در بیماران مبتلا به HCM معمولا افزایش در توده عضلانی بطن چپ، بی نظمی سلول عضله یا فیبروز علت آریتمی محسوب می شود (7-4). میزان فیبروز عضله قلبی با اختلال در آرامش قلب و افزایش نارسایی قلبی در ارتباط است. در مدل های حیوانی ترانس ژنیک HCM، ارتباط روشنی بین میزان فیبروز قلبی و یا بی نظمی سلول عضله و خطر آریتمی نشان داده شده است (8،9). از علت های این بیماری می توان گاهی بیماری ثانویه مثل پر فشاری مزمن خون و یا تنگی دریچه ای یا بیماری های ارتشاحی قلب را نام برد؛ اما نوع اولیه (ایدئوپاتیک) ناشی از اختلال ژنتیکی می تواند در هر سنی رخ دهد. برخی بیماران دارای سابقه خانوادگی هستند؛ اما موارد بدون سابقه خانوادگی هم دیده می شود. این فرم درگیری یکی از شایع ترین علل مرگ ناگهانی قلب است. دامنه آن از فقدان علائم بیماری در تمام عمر تا پیشرفت سریع نارسایی قلبی یا مرگ قلبی ناگهانی در ابتدا و گاهی اوقات با کمی و یا حتی بدون هایپرتروفی است (2). اولین کاردیومیوپاتی که به علت ژنتیکی نسبت داده شده است، کاردیومیوپاتی هایپرتروفی می باشد که علت بیماری در بیش از 50% از موارد جهش های ژنی شناسایی شده است (10). جهش در 23 ژن سارکومری یا پروتئین های مرتبط با سارکومر، با HCM در ارتباط است (11،12). عمدتا تغییرات در دو ژنMYH7 وMYBPC3 (که کد کننده پروتئین C متصل شونده به میوزین قلبی است)، عامل بیش از 75% از تمام موارد بالینی HCM است که در آن زمینه ای از جهش تعریف شده است. جهش در پروتئین های رشته های نازک، مانند تروپونین T عضله قلب، تروپونین I عضله قلب و تروپومیوزین کمتر از 10% موارد HCM را تشکیل می دهند (13). تنوع قابل توجه در فنوتیپ بالینی HCM تا حدودی به علت جهش های ژنی بیماری زای متعدد است. حتی جهش مشابه در یک خانواده می تواند باعث تنوع قابل ملاحظه ای در نفوذ بیماری، سن شروع علائم، فنوتیپ بالینی و نتیجه شود. این مشاهدات نشان می دهد که فراتر از تغییر خاص در ساختار و عملکرد یک پروتئین جهش یافته، اصلاح کننده های دیگری برای بیماری باید وجود داشته باشند، مانند واریانت های ژنتیکی شایع و یا متوسط در کل ژنوم، یا بر هم کنش ژنتیکی- محیطی از طریق سیگنال اپی ژنتیک جهش های MYBPC دارای نفوذ ناقص هستند و منجر به بروز دیر رس و دوره خوش خیم بیماری می شوند (14). جهش های MYBPC با پیش آگهی ضعیف همراه هستند (15). در صورتی که جهش های بیماری زا در بیماران مبتلا به HCM تشخیص داده شود، خطر بروز عوارض نامطلوب مانند مرگ قلبی- عروقی، سکته مغزی غیر کشنده و یا پیشرفت نارسایی قلبی، 3 تا 4 برابر افزایش را در مقایسه با بیماران مبتلا به HCM که در آن ها جهش های بیماری زا شناسایی نشده است، نشان می دهد (17-15). شیوه زندگی، جنس و زمینه ژنتیکی، چندین عامل اصلاح کننده برای توجیه تنوع فنوتیپی بالا در HCM هستند (20-18). سیستم رنین- آنژیوتانسین- آلدوسترون نقش مهمی به عهده دارند (21،22). به عنوان مثال، بین تنوع ژنتیکی آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین (کدگذاری شده توسط ACE) و میزان هایپرتروفی در بیماران مبتلا به HCM، ارتباطی یافت شده است (21). بررسی ژنتیکی موجب تسهیل تشخیص بیماری در مراحل پیش کلینیکی می شود که این موجب پیشرفت های زیادی در شناخت مبنای ژنتیکی بیماری شده است. تشخیص بیماری با توجه به تعیین ژنوتیپ بیماران روز به روز بیشتر می شود و به خصوص که وجود روش های دارویی و مداخله ای برای پیشگیری از مرگ ناگهانی افراد مستعد، اهمیت موضوع را بیشتر می کند؛ همچنین طبقه بندی میزان خطر زایی بیماری بر اساس معیارهای مولکولی قابل انجام است. جهش در ژن MYBPC3، عامل حدود 40% از موارد بالینی HCM است که این موضوع ضرورت بررسی این ژن را آشکار می کند. ژن MYBPC3 از 21296 جفت باز تشکیل شده و دارای 35 اگزون است که 34 تا از آن ها کد کننده پروتئین cMYBP-C با 1172 اسید آمینه هستند. 2 تا از اگزون ها به صورت غیر معمولی از نظر اندازه کوچک هستند و هر کدام 3 جفت باز دارند. طول کامل cDNA 5/4 کیلو باز است که 1173 باز، آمینو اسیدی را کد می کند (23). تکنیک چند شکلی ساختار تک رشته ای (SSCP) در سال 1989 توسط Orita و همکاران ابداع شد. SSCP یک تکنیک ساده، ارزان و حساس است و در واقع یک روش غربالگری بر محصولات PCR جهت جداسازی نمونه های دارای جهش می باشد (24). تحت شرایط بهینه این تکنیک می تواند تفاوت های تک بازی را شناسایی کند. این روش مبتنی بر حرکت متفاوت تک رشته های DNA روی ژل پلی آکریل امید است (24). به همین دلیل با استفاده از روشSSCP می توان به طور دقیقی به تغییر در بازهای رشته DNA پی برد و این تغییرات را بررسی کرد. SSCP برای تشخیص جهش های نقطه ای مفید است و هتروداپلکس به حذف و اضافه شدن حساس است. در نتیجه آنالیز ترکیبی آن ها باعث افزایش حساسیت تشخیص می شود. هتروداپلکس ها بین آلل های متفاوت DNA شکل می گیرند. در این روش قطعات DNA نرمال و جهش یافته با هم مخلوط می شوند، سپس در دمای oC95 قرار می گیرند تا دناتوراسیون انجام شود و بعد در دمای اتاق قرار می گیرند تا اتصال مجدد رشته ها به صورت آرام در دمای اتاق انجام گیرد. اگر DNA هدف شامل آلل های متفاوتی باشد، هتروداپلکس ها به صورت خودکار شکل می گیرند و نتیجه آن تشکیل دو هموداپلکس و دو هتروداپلکس است که در ژل آکریل آمید با تاخیر حرکت می کنند (25)؛ بنابراین با انجام هم زمان روش SSCP و هتروداپلکس در ژل، حساسیت تشخیص در هر دو روش افزایش می یابد که به میزان بیش از 95% برای جهش های بی معنی و بد معنی تخمین زده شده است (26).
در ایران مطالعات معدودی در زمینه های ژنتیکی HCM انجام شده است که از میان می توان به مطالعه حیدری و همکاران اشاره کرد که جهش ها در اگزون های 15-12 و 23-19 ژن MYH7 را در بیماران مبتلا به کاردیومیوپاتی هایپرتروفی در استان چهارمحال و بختیاری مورد بررسی قرار داد (27،28) از آنجا که در مطالعات انجام شده در دیگر کشورها در اگزون های 30 و 33 ژن MYBPC3 در بیماران مبتلا به HCM جهش گزارش شده است؛ لذا این مطالعه با هدف بررسی حضور جهش های احتمالی در اگزون های 30 و 33 ژن MYBPC3 در استان چهارمحال و بختیاری طراحی و اجرا شده است.
مطالعه که در محدوده زمانی مهر ماه 92 تا آبان ماه 93 انجام شد، از بین بیماران مراجعه کننده به کلینیک قلب دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد تعداد 30 نمونه از خون افراد مبتلا به کاردیومیوپاتی هایپرتروفی در استان چهارمحال و بختیاری، پس از کسب رضایت نامه از افراد مبتلا و یا والدین آن ها و تکمیل پرسشنامه مربوط به اطلاعات بالینی و دموگرافیک، دریافت شد. بر اساس یافته های اکوکاردیوگرافی و بالینی افرادی که ضخامت دیواره بطن چپ آن ها از 13 میلی متر بیشتر بود و بیماری آن ها وراثتی بود، وارد مطالعه شدند (جدول شماره 1) (30-28). از هر فرد به میزان 5 میلی لیتر خون محیطی دریافت شد و به ازای هر میلی لیتر خون 10 میکرولیتر EDTA استفاده شد و برای آزمایشات مولکولی به مرکز تحقیقات سلولی و مولکولی واقع در دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد منتقل شدند و در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
در این مطالعه جهت استخراج DNA از روش استاندارد فنل- کلروفرم استفاده شد (30). به منظور بررسی میزان خلوص DNA در این مطالعه از روش اسپکتروفتومتری (اسپکتروفتومتر NANODROP 2000 USA) استفاده شده است. جهت طراحی پرایمر ساختمان کامل ژن MYBPC3، با استفاده از سایت اینترنتی NCBI شناسایی شد. اگزون های 30 و 33 این ژن انتخاب گردید و با استفاده از برنامه نرم افزاری Gene runner پرایمرهای لازم جهت انجام واکنش های زنجیره ای پلیمراز PCR طراحی و از شرکت ژن فناوران خریداری شدند. در این مطالعه از پرایمرهای تغییر یافته که در انتهای 4 یا 5 نوکلئوتیدی ''3 هر پرایمر پیشرو ترجیحا بازهای پیریمیدین (C به T و T به C) و بعضا بازهای پورین تعویض شده اند، نیز استفاده شد. بدین منظور نمونه هایی که محصول PCR آن ها با استفاده از پرایمر جهش یافته (site directed mutagenesis) باشند، به عنوان نمونه های کنترل مثبت بوده و در باندهای ژل SSCP دارای تغییر و حرکت متفاوت خواهند بود. پرایمرهای جهش یافته در جدول شماره 2 با علامت (*) مشخص شده اند.
در مطالعه حاضر، برای تکثیر نواحی مورد نظر، واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (ASTEC ژاپن)، در حجم 25 ماکرولیتر انجام شد. مخلوط واکنش شامل اجزاء زیر بود: 5/2 ماکرولیتر بافر PCR (X 10) (سیناژن چین)، 4 ماکرولیتر منیزیم کلراید (50 میلی مولار)، 2/0 ماکرولیتر از مخلوط dNTP (10 میلی مولار) (سیناژن چین)، 5/0 ماکرولیتر از هر کدام از پرایمرها (50 ماکرو مول)، 2 ماکرولیتر از DNA ژنومیک و در نهایت 25/0 ماکرولیتر از آنزیم Taq پلیمراز (5 واحد بر ماکرولیتر) (سیناژن چین). پس از انجام چندین PCR و تغییر غلظت منیزیم کلراید در هر واکنش و با بررسی ژل های رنگ آمیزی شده محصولات PCR، بهترین کیفیت باندهای محصولات PCR در غلظت 50 میکرو مولار از منیزیم کلراید مشاهده شد؛ بنابراین برای انجام PCR از غلظت 50 میلی مولار منیزیم کلراید استفاده کردیم. برنامه دمایی تنظیم شده برای اگزون های مورد مطالعه در جدول شماره 3 آمده است.
2 میکرولیتر از محصولات PCR روی ژل پلی آکریل آمید 8% و با ولتاژ 300 ولت و به مدت 45 دقیقه الکتروفورز شدند و سپس ژل ها به روش نیترات نقره رنگ آمیزی شده و رویت گردید. در صورت تایید کیفیت باندها محصولات PCR آن ها جهت SSCP مورد استفاده قرار گرفتند. برای هر نمونه به میزان 5 میکرولیتراز محصولات PCR را با 5 میکرولیتر از SSCP Dye در یک میکروتیوب مخلوط نمودیم. میکروتیوب ها را به مدت 15 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی گراد روی هات پلیت قرار دادیم، تا دو رشته DNA کاملا از هم باز شوند. برای جلوگیری از اتصال مجدد رشته ها، بلافاصله میکروتیوب ها را بر روی یخ قرار دادیم. نمونه ها حداقل 5 دقیقه بر روی یخ ماندند. برای SSCP/HA نیز 2 میکرولیتر از DNA محصول PCR با 7/2 میکرولیتر EDTA مخلوط کرده و طبق برنامه Touch Down در دستگاه PCR(corbett استرالیا) قرار دادیم (جدول شماره 4).
ژل پلی اکریل آمید مربوط به SSCP/HA به نسبت 39:1 از بیس اکریل آمید: اکریل آمید (MERCK آلمان) تهیه گردید و در تانک الکتروفورز قرار گرفت. از بافر X6/0TBE در تانک استفاده گردید. نمونه ها پس از مدت زمان لازم به داخل چاهک های ژل ریخته شدند. مدت زمان و ولتاژ لازم برای نمونه های مختلف متفاوت می باشد و باید برای هر نمونه شرایط دمایی، ولتاژ و زمان مطلوب با انجام آزمایشات متعدد و کسب تجربه به دست آید.
شرایط تنظیم شده جهت انجام الکتروفورز SSCP و SSCP/HA اگزون های 30 و 33 ژن MYBPC3 غلظت ژل 10%، آمپر 31 میلی آمپر، ولتاژ 350-320 ولت، دما oC 12، زمان 8 ساعت می باشد.
پس از مدت زمان لازم با استفاده از نیترات نقره ژل پلی اکریل آمید رنگ آمیزی شدند و باندهای تشکیل شده، مورد بررسی قرار گرفتند. هیچ نمونه مشکوکی در ژل SSCP مشاهده نشد، بنابراین نیازی به تعیین توالی نبود.
جمعیت مورد مطالعه، شامل: 30 نفر از افرادی بود که دیواره بطن چپ آن ها حداقل 13 میلی متر ضخامت داشت. برخی از افراد دارای سابقه فامیلی از بیماری و بعضی بدون سابقه فامیلی از بیماری بودند (28). افراد انتخاب شده برای نمونه گیری دارای کاردیومیوپاتی هایپرتروفی با علت ژنتیکی بودند و تمام افرادی که دارای علل غیر ژنتیکی بودند، از مطالعه حذف شدند. نتایج جمعیت مورد مطالعه، پس از الکتروفورز نمونه های DNA استخراج شده، مشخص شد که از کیفیت بالایی برخوردار هستند و هیچ گونه آلودگی ظاهری ندارند. نسبت جذب 280/260 برابر 8/1 بود که بیانگر عدم وجود ناخالصی است. طول قطعه تکثیر شده برای اگزون 30، 316 جفت باز و برای اگزون 33، 282 جفت باز می باشد. واکنش SSCP/HA، نتایج حاصل از الکتروفورز SSCP/HA اگزون های 30 و33 ژن MYBPC3 در ژل پلی اکریل آمید در تصویر شماره 1 و2 نشان داده شده است.
نمونه های کنترل مثبت که پرایمر پیشرو آن ها دارای جهش ساختگی بود، در تمام تصاویر دارای حرکت متفاوت بوده و با حرف C مشخص شده است. سایر موارد که با عدد مشخص شده اند، مربوط به نمونه های بیماران هستند. همان گونه که در تصویر شماره 1 و 2 مشخص شده، در هر دو اگزون 30 و 33، در هیچ یک از نمونه های بیماران تغییری مشاهده نشد.
تصویر شماره 1: ژل پلی اکریل آمید الکتروفورز SSCP/HA مربوط به اگزون 30 ژن MYBPC3 M: مارکر؛ C: نمونه کنترل مثبت که هم DNA تک رشته ای و هم DNA دو رشته ای آن متفاوت بودند؛ 1-21: نمونه های بیماران که در اگزون 30 آن ها هیچ گونه باند متفاوتی مشاهده نشد و در نتیجه فاقد جهش بودند.
تصویر شماره 2: ژل پلی اکریل آمید الکتروفورز SSCP/HA مربوط به اگزون 33 ژن MYBPC3 M: مارکر؛ C: نمونه کنترل مثبت که هم DNA تک رشته ای و هم DNA دو رشته ای آن متفاوت بودند؛ 1-21: نمونه های بیماران که در اگزون 33 آن ها هیچ گونه باند متفاوتی مشاهده نشد و در نتیجه فاقد جهش بودند.
بحث: این تحقیق با استفاده از روش PCR-SSCP/HA و با هدف شناسایی جهش های ژن MYBPC3 در بیماران مبتلا به کاردیومیوپاتی هایپرتروفی در استان چهارمحال و بختیاری انجام شد. این روش ساده، ارزان و حساس که قادر به شناسایی تغییر در یک باز منفرد در قطعه DNA می باشد، در تحقیق های برخی محقیق توضیح داده شد (24،31). شرایط مطلوب PCR-SSCP برای هرکدام از اگزون های مورد مطالعه با چندین بار تکرار آزمایش و به صورت تجربی به دست آمد. به منظور ارتقاء کیفیت تحقیق، تمام شرایط تکنیک PCR-SSCP رعایت شد. این روش دارای دقت 100% نیست؛ اما با استفاده از نمونه های کنترل می توان دقت را به 100% رساند. نمونه هایی که در این مطالعه به عنوان کنترل مثبت ایجاد کردیم، هم زمان با نمونه های دیگر روی ژل برده شدند و الگوی متفاوتی ایجاد کردند که نشان دهنده صحت واکنش انجام شده است. علاوه بر این، با کاربرد روش هایی مانند هتروداپلکس می توان دقت را افزایش داد؛ بنابراین روش هتروداپلکس نیز هم زمان با PCR-SSCP به کار رفت. این روش قادر به شناسایی بازهای جفت شده ناجور با کارایی و دقت بالا است. در این مطالعه از تکنیک PCR-SSCP با دقت بالا استفاده شد و نتایج این روش با آزمایشات دیگر تایید شدند؛ بنابراین داده های این تحقیق با اطمینان کامل ارائه شده است.
در یک مطالعه در هندوستان غربالگری اگزون های ژن MYBPC3 انجام شد. پس از انجام آنالیز به وسیله ی تکنیک SSCP، یک جهش در اگزون شماره 19 و نیز یک SNP در اگزون شماره 31 مشاهده شد (32). حذف bp25 در اگزون 32 ژن در هند و در رابطه با HCM شناسایی شد (33). یک حذف25جفت بازی معمول در اگزون 32 ژن MYBPC3 منجر به شناسایی ارتباط آن با کاردیومیوپاتی با فراوانی 4% در آسیای شمالی شد (34). در مطالعه حاضر که با هدف تعیین جهش ها در اگزون های 30 و 33 ژنMYBPC3 در بیماران مبتلا به HCM در استان چهارمحال و بختیاری انجام شد، نتایج زیر حاصل شدند: در اگزون 30 ژن MYBPC3 هیچ گونه جهشی مشاهده نشد. در دیگر مطالعات
انجام شده نیز در اگزون 30 ژن MYBPC3 در بیماران مبتلا به HCM تغییر گزارش شده بود که برخی از آن ها به شرح زیر می باشند: در مطالعه ای که به طور مشترک در آلمان و ترکیه انجام شد، در اگزون 30 ژنMYBPC3 جهش insAA1042 در موقعیت Ins of AA at nt 3156 و جهش delG1047 در موقعیت Del of G at nt 3171 شناسایی شد که هر دو منجر به از دست رفتن جایگاه اتصال میوزین بودند (35). در مطالعه ای که در اسپانیا انجام شد، در اگزون 30 ژنMYBPC3 جهش R1022S در موقعیت c.C3064A شناسایی شد (36).
در مطالعه حاضر در اگزون 33 ژن MYBPC3 در هیچ کدام از نمونه ها تغییری مشاهده نشد. در حالی که در سایر مطالعات انجام شده، در اگزون 33 ژن MYBPC3 در بیماران مبتلا به HCM تغییر گزارش شده بود که در زیر به برخی از آن ها اشاره شده: در مطالعه ای که در فرانسه انجام شد، در اگزون 33 ژنMYBPC3 ، اختلال در چارچوب خواندن به صورت یک مضاعف شدگی شناسایی
شد (37). در مطالعه ای که در آمریکا انجام شد، در اگزون 33 ژنMYBPC3 تغییر نوکلئوتیدی Tمحل های اتصال برای میوزین و تیتین است (40). در مطالعه حاضر، در اگزون 30 ژن MYBPC3 تغییری مشاهده نشد و نتیجه می گیریم که جهش اگزون 30 ژن MYBPC3 در بیماری زایی کاردیومیوپاتی هایپرتروفی در استان چهارمحال و بختیاری نقش ندارد. در اگزون 33 ژن MYBPC3 نیز در هیچ کدام از نمونه ها تغییری مشاهده نشد؛ بنابراین می توان نتیجه گرفت که جهش در اگزون 33 ژنMYBPC3 در بیماری زایی کاردیومیوپاتی هایپرتروفیدر استان چهارمحال و بختیاری بی تاثیر است. دلیل آن می تواند وجود ژن های مختلفی باشد که در HCM نقش دارند و جهش در آن ژن ها منجر به بروز بیماری می گردد؛ همچنین علت آن می تواند، وجود جهش در اگزون های دیگر ژن MYBPC3 باشد. در حالی که در سایر مطالعات انجام شده در دیگر مناطق، در اگزون 30 و 33 ژن MYBPC3 در بیماران مبتلا به HCM تغییر گزارش شده بود. علت احتمالی تفاوت در نتیجه حاصله می تواند تفاوت در ژنتیک منطقه ای بیماری باشد. به منظور شناخت بیشتر اساس ژنتیکی این بیماری و برای کسب اطلاعات مورد نظر جهت پیشگیری و مدیریت اختلال عملکرد قلبی وابسته به ژن MYBPC3، مطالعات بیشتری جهت بررسی دقیق تر جهش های این ژن در سایر اگزون ها لازم به نظر می رسد.

نتیجه گیری

بر اساس نتایج این مطالعه جهش در اگزون های 30 و 33 ژن MYBPC3 نقشی در ایجاد بیماری کاردیومیوپاتی هایپرتروفی در جمعیت استان چهارمحال و بختیاری نداشته است و می طلبد که جهت بررسی علت بیماری HCM، دیگر اگزون های این ژن و نیز ژن های دخیل دیگر در این بیماری اقدام شود.