ایجاد جهش هدفدار در ژن IFNβ به منظور افزایش پایداری mRNA و سطح ترجمه آن با روش Megaprimer PCR

پروتئین اینترفرون بتا (IFNβ) به عنوان یک داروی نوترکیب تولید شده و در درمان برخی بیماری ها مثل مالتیپل اسکلروزیس استفاده می شود. در سلول های یوکاریوتی mRNA IFNβ به سرعت تجزیه می شود و نیمه عمر آن بسیار کوتاه است. یکی از عواملی که باعث این امر می شود وجود توالی غنی از AU (ARE) در UTR 3 این mRNA می باشد. این ناحیه اثر مهاری بر ترجمه نیز دارد. هدف این تحقیق حذف ARE از ژن اینترفرون بتا جهت افزایش پایداریmRNA و سطح ترجمه می باشد.
به منظور حذف یک توالی 18 نوکلئوتید از ARE از روش Megaprimer PCR استفاده شد. محصول PCR با آنزیم های EcoRI و BglII برش داده شد. وکتور نیز توسط همین آنزیم ها اما به صورت نسبی برش داده شد. محصول برش یافته PCR خالص سازی شد و داخل وکتور کلون شد. در ادامه وکتور نوترکیب حاصل به رده سلولی CHO ترانسفکت شدند.
محصول مرحله اول واکنش PCR حاوی جهش حذفی بود و به عنوان مگاپرایمر در واکنش دوم استفاده شد. هضم نسبی وکتور، قطعاتی با وزن های مختلف ایجاد کرد. قطعه مورد نظر ما از ژل استخراج و به عنوان وکتور کلونینگ استفاده شد. محصول نهایی PCR داخل وکتور کلون شد. صحت واکنش کلونینگ تایید شد و وکتور نوترکیب حاصل، به رده سلولی CHO ترانسفکت شد.
منطقه ای 18 نوکلئوتیدی از mRNA IFNβ حذف شد. اثر این میکروحذف بر پایداری mRNA و بازدهی ترجمه درآینده بررسی خواهد شد.