همسانه سازی ژن پیروات دکربوکسیلاز موثر در تولید بیواتانول در باکتری اشرشیا کلای

اتانول ساخته شده از زیست توده یکی از راهبردهای بی نظیر و سودمند از لحاظ اقتصادی و محیطی است و می تواند به عنوان یک سوخت پاک و ایمن، جایگزین سوخت های فسیلی شود .
در این پژوهش کلیدی ترین آنزیم موثر در مسیر تولید اتانول زیستی (پیروات دکربوکسیلاز) از زایموموناس موبیلیس انتخاب و در اشرشیا کلای به روش ذوب-انجماد همسانه سازی شد. برای همسانه سازی ژن مدنظر از آغازگرهای اختصاصی ژن پیروات دکربوکسیلاز و واکنش پی سی آر استفاده شد. سپس ژن پیروات دکربوکسیلاز و پلاسمید pET 28a را آنزیم های محدودکننده Sal I و Xho I برش دادند؛ محصولاتی که آنزیم لیگاز برش دادند در دمای 16 درجه سانتی گراد و در مدت 16 ساعت به همدیگر متصل شدند.
کشت باکتری ها در محیط کشت LB انتخابی نشان داد که تنها کلونی های حاوی پلاسمید pET 28a قادر به رشد هستند. نتایج کلونی پی سی آر با آغازگرهای اختصاصی باندهایی در اندازه تقریبی 1700 جفت باز را نشان داد. نتایج مربوط به پی سی آر پلاسمیدهای نوترکیب توسط آغازگر رفت راه انداز T7 و آغازگر برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز، جهت صحیح درج ژن در داخل پلاسمید را ثابت کرد و باندی به اندازه 1885 جفت باز را نشان داد و نتایج هضم آنزیمی پلاسمیدpET 28a pdc نوترکیب توسط آنزیم های Sal I و Xho I باندهای مشابهی را آشکار کرد. درنهایت واکنش RT باند مورد انتظار 1700 جفت باز را نشان داد که حاکی از بیان ژن مورد نظر در این نمونه ها بود.
از مهم ترین مشکلات در بیوسنتز اتانول، محدودیت عملکرد آنزیم های درگیر در مسیر بیوسنتز اتانول از مواد اولیه نظیر ضایعات کشاورزی است؛ این آنزیم ها در تبدیل مواد اولیه پلی مری به مواد اولیه با ساختار ساده و قابل تخمیر نقش اساسی دارند. به نظر می رسد افزایش بیان ژن پیروات دکربوکسیلاز تحت کنترل پروموتور قوی T7 منجر به افزایش تولید محصول نهایی خواهد شد .