طراحی، کلونینگ و بررسی بیان ژن NP در وکتور دوسیسترونی واجد ژن IL-18 موشی با هدف استفاده در مطالعات واکسن آنفلوانزا

در حال حاضر واکسیناسیون مهمترین استراتژی در کاهش آمار مبتلایان و مرگ و میر سالیانه ناشی از آنفلوانزا فصلی تلقی می گردد. بر خلاف آنتی ژنهای سطحی مورد استفاده در ترکیب واکسن های موجود، پروتئین های داخلی ساختاری و غیر ساختاری ویروس آنفلوانزا به خوبی حفاظت شده هستند. با توجه به سطح حفاظت شدگی نسبتا بالای نوکلئوپروتئین ویروس آنفلوانزا و قابلیت ادجوانتی IL-18 در تحریک پاسخ های ایمنی و شیفت به Th1، این مطالعه در صدد ساخت یک پلاسمید دوسیسترونی با قابلیت بیان ژن های NP و IL-18 موشی بود تا در صورت نیل به این هدف به عنوان یک کاندید واکسن قابلیت ایمنی زایی آن در مطالعات بعدی مورد ارزیابی قرار گیرد.
در مرحله اول RNA ژنومی ویروس آنفلوانزا تیپA سویه H1N1/ PR8 استخراج شد و پس از تولید cDNA، توالی ژن کد کننده ی NP با استفاده از پرایمر اختصاصی ژن و با روش PCR تکثیر شد. در مرحله ی بعد ژن NP در وکتور کلونینگ pJET1.2/blunt همسانه سازی شد. پس از تایید صحت کلونینگ ژن در وکتور pJET1.2/blunt از طریق تعیین توالی، هضم آنزیمی و PCR، قطعه مزبور توسط هضم آنزیمی دو گانه خارج گردید. پلاسمید pIRES-Igk/mIL18/Fc با استفاده از آنزیمهای BstXI/NotI هضم دوگانه شد و قطعه مربوط به eGFP خارج شد. سپس فرآیند الحاق ژنNP در وکتور دوسیسترونی pIRES-Igk/mIL18/Fc هضم شده با استفاده از آنزیم T4 Ligase صورت پذیرفت. محصول لیگاسیون به سویه استاندارد DH5α ترانسفورم شد و انتخاب کلونی های مثبت با استفاده از PCR colony صورت پذیرفت. به منظور بررسی صحت کلونینگ از تست PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی استفاده شد. در نهایت بیان ژن NP و IL-18 از سازه ژنی mIL-18-pIRES2-NP در رده سلولی BHK-21 و RAW264.7 ترانسفکت شده با پلاسمید به وسیله ی رنگ آمیزی ایمنوفلورسنت غیر مستقیم و الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی به صورت دو جهته نشان داد که ژن NP ویروس آنفلوانزا در وکتور pIRES-Igk/mIL18/Fc به صورت موفق و در جهت درست کلون شده است. ترانسفکشن و بررسی قابلیت بیان سازه ژنی mIL-18-pIRES2-NP با استفاده از رنگ آمیزی ایمنوفلوئورسانس و الایزا بیان موفق آمیز ژنهای NP و IL-18 از mIL-18-pIRES2-NP در سلول یوکاریوتی را اثبات کرد.
نتایج بدست آمده در این تحقیق بیان موفقیت آمیز ژن NP و IL-18 از سازه mIL-18-pIRES2-NP را نشان داد. با توجه به اثرات ادجوانتی سایتوکاین IL-18، پلاسمید ساخته شده می تواند به عنوان یک کاندید مناسب واکسن ژنی برای پیش گیری از عفونت ناشی از ویروس آنفلوانزا در مطالعات ارزیابی ایمنولوژیک آتی مطرح گردد.