Determination of Temperature Sensitive Plasmid Copy Number in Escherichia coli by Absolute and Relative Real Time Quantitation PCR
Abstract:
Background
Temperature sensitive plasmid pBBR1MCS2-Ts, mutated from pBBR1MCS and derived from pBBR1, is a broad host range plasmid and it is especially useful for gene targeting and integration in various hosts. The plasmid copy number (PCN) of temperature sensitive plasmid in host mainly depends on the stability of plasmid.
Objectives
The present study aimed at investigating the PCN of pBBR1MCS2-Ts and pBBR1MCS2 at permissive (30°C) or nonpermissive (42°C) temperatures.
Methods
The rep gene in the plasmid and the dxs gene in the Escherichia coli genome were used as target and reference gene. A standard plasmid pLB1k-dxs-rep was constructed for real time PCR calibration. The PCNs were calculated by absolute and relative quantitation. Total DNA of E. coli T1 harboring plasmid pBBR1MCS2 or pBBR1MCS2-Ts were extracted and real time qPCR were performed in triplicate, with 2 independent biological replicates.
Results
The primer sets Qrep and Qdxs produced specific products and could be used to detect the target plasmid and chromosomal DNA, respectively. The PCN determined by the absolute and relative quantitation PCR were similar and reproducible. The PCN of pBBR1MCS2 in E. coli was about 19 when cultured at 30°C and about 10 when cultured at 42°C, and the PCN of pBBR1MCS2-Ts was about 6 when cultured at 30°C and nearly zero when cultured at 42°C. Compared with pBBR1MCS2, the temperature shift from 30°C to 42°C caused a significant decrease in the PCN of temperature sensitive plasmid pBBR1MCS2-Ts.
Conclusions
The PCN of temperature sensitive plasmid was very low at 42°C and temperature sensitivity of the plasmid was mainly caused by the mutation of rep ORF, which subsequently affected the plasmid replication and stability.
Language:
English
Published:
Jundishapur Journal of Microbiology, Volume:10 Issue: 7, 2017
Page:
8
magiran.com/p1731598  
برخی از خدمات از جمله دانلود متن مقالات تنها به مشترکان مگیران ارایه می‌گردد. شما می‌توانید به یکی از روش‌های زیر مشترک شوید:
اشتراک شخصی
در سایت عضو شوید و هزینه اشتراک یک‌ساله سایت به مبلغ 400,000ريال را پرداخت کنید. همزمان با برقراری دوره اشتراک بسته دانلود 100 مطلب نیز برای شما فعال خواهد شد!
اشتراک سازمانی
به کتابخانه دانشگاه یا محل کار خود پیشنهاد کنید تا اشتراک سازمانی این پایگاه را برای دسترسی همه کاربران به متن مطالب خریداری نمایند!
توجه!
  • دسترسی به متن مقالات این پایگاه در قالب ارایه خدمات کتابخانه دیجیتال و با دریافت حق عضویت صورت می‌گیرد و مگیران بهایی برای هر مقاله تعیین نکرده و وجهی بابت آن دریافت نمی‌کند.
  • حق عضویت دریافتی صرف حمایت از نشریات عضو و نگهداری، تکمیل و توسعه مگیران می‌شود.
  • پرداخت حق اشتراک و دانلود مقالات اجازه بازنشر آن در سایر رسانه‌های چاپی و دیجیتال را به کاربر نمی‌دهد.