افزایش بیان اختصاصی ژن Cdk9 بوسیله microRNA-1 بالغ تک رشته در سلول های فیبروبلاست

microRNA ها، RNA کوچک (bp22)غیر کد شونده هستند که قادرند بیان ژنها را از مسیرهای جلوگیری از ترجمه، رونویسی و تخریب RNA مهار کنند. با وجود نقش تنظیمی miR ها در شرایط فیزیولوژیک، تغییر بیان microRNA ها در شرایط بیماری مانند سرطان مشاهده می شود. بنابرین به منظور تنظیم میزان بیان miRها در شرایط بیماری و یا جهت مطالعه نقش تنظیمی آنها، بیان microRNA ها را با استفاده از وکتور های بیان کننده و یا از طریق سنتز miR بالغ دو رشته ای افزایش می دهند.
در این مطالعه تجربی تاثیر تنظیمی miR-1 تک رشته ای و دو رشته ای بر بیان ژن Cdk9 بررسی شد. سلول های فیبروبلاست موشی در محیط DMEM حاوی 10 درصد سرم، 100 U/ml پنی سیلین، و 0.1 mg/ml استرپتومایسین کشت داده شدند. به منظور افزایش بیان miR-1 در سلول های فیبروبلاست، پلاسمید بیان کننده miR-1 (pPRO-miR-1)، miR-1 سنتزی دو رشته ای و تک رشته ای (3 گروه ) با استفاده از لیپوفکتامین 2000 (Invitrogen، 11668-027) و طبق پروتکل های موجود به سلول ها ترانسفکت شده و RNA سلول ها بعد از 48 ساعت بوسیله محلول کیازول (Qiagen، Germany) استخراج گردید. cDNA سازی از2 μg RNA در حضور آنزیم MLV ریورس ترنسکریپتاز و پرایمرهای Random hexamer و پرایمر اختصاصی microRNA-1 (شرکت زیست رویش) انجام شد. جهت انجام q-PCR از کیت SYBR Green I Master Mix استفاده شد. جهت بررسی اختلاف بین گروه ها از آزمون واریانس ANOVA استفاده شد و سطح اختلاف معناداری بین گروه ها (p value) کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.
پس از ترنسفکت سلول ها با پلاسمید بیان کننده miR-1 (pPRO-miR-1)، کاهش 2 برابر بیان ژن Cdk9 در سلول های ترنسفکت شده نسبت به گروه کنترل با انجام آزمایش Real time PCR نشان داده شد (p <0.01 ). نتایج مشابهی بعد از ترنسفکت سلول ها با miR-1 بالغ دو رشته ای (22 نوکلئوتید) مشاهده شد. در ادامه با هدف مقایسه نقش تنظیمی miR-1 بالغ دورشته با تک رشته، سلول ها با miR-1 بالغ تک رشته (22 نوکلئوتید) ترنسفکت شدند. نتایج حاصل از آزمایش q-PCR و وسترن بلات نشان داد که miR-1 بالغ تک رشته برخلاف miR-1 دورشته و یا پلاسمید بیان کننده miR، حدود 2 برابر میزان بیان Cdk9 افزایش می دهند (p <0.001).
نتیجه گیری بر خلاف پلاسمید بیان کننده microRNA و miR بالغ دو رشته ای که باعث کاهش بیان ژن هدف می شوند، احتمال دارد microRNA تک رشته نقش فعال کننده بیان ژن هدف را داشته باشد.