همسانه سازی ژن کراتیناز در اشرشیاکلی و بررسی برخی از خصوصیات بیوانفورماتیکی آن

کراتیناز از آنزیم های پروتئولیتیک در طبیعت می باشد. این آنزیم تنها در حضور سوبسترای کراتین تولید می شود و عمدتا پیوندهای دی سولفیدی را مورد هدف قرار می دهد. در این مطالعه از سویه باکتریاییBacillus licheniformis که قبلا از بستر مرغداری جدا شده بود، برای استخراج ژن کراتیناز استفاده شد. واکنش تکثیر ژن کراتیناز با روش PCR با استفاده از DNA ژنومی استخراج شده از باکتری بومی انجام شد. پس از خالص سازی، ژن کراتیناز با روش همسانه سازی T/A به ناقل pTZ57R/T منتقل شد. پس از انجام واکنش اتصال بین محصول PCR و حامل pTZ57R/T، ترنسفورم محصولات لایگیشن به باکتری اشرشیاکلی سویه DH5α صورت گرفت. انجام واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای F. B. 1 و R. B. 1 روی پلاسمید ker- pTZ57R/T، منجر به تکثیر ژن کراتیناز به طول 1164 جفت باز شد که دارای توالی برش آنزیم های XhoI و NcoI برای انتقال مناسب به وکتور بیانی (+)pET-26b بودند. استخراج پلاسمید نوترکیب از کلنی های شناسایی شده صورت گرفت و به باکتری اشرشیاکلی سویه BL21 انتقال داده شد که رشد کلنی های باکتریایی بر روی محیط LB آگار حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین نشان از انتقال موفقیت آمیز سازه ker-pET-26b(+) به این سویه داشت. تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن مورد نظر انجام شد. وزن مولکولی پس از ترجمه توالی نوکلئوتیدی به توالی پروتئینی معادل 88/39879 کیلو دالتون تخمین زده شد. بار خالص پروتئین معادل 009/0- با ضریب آلیفاتیک 73/84 و دارای سیگنال پپتیدی می باشد. این آنزیم یک سرین پروتئاز با جایگاه های فعال اسیدآمینه آسپارتیک 137، هیستیدین 168 و اسید آمینه سرین 325 می باشد. به طورکلی نتایج مطالعات بیوانفورماتیکی نشان می دهد که آنزیم کراتیناز مورد مطالعه در دسته آنزیم های پایدار قرار می گیرد که قابلیت استفاده در صنایع مختلف را دارا می باشد.