توسعه روش موثر باززایی و ترانسفورماسیون توتون از طریق بهینه سازی غلظت تنظیم کننده های رشد و ساکارز

گیاه توتون یک بیوراکتور بسیار کارا به منظور تولید پروتئین های نوترکیب می باشد، لذا در این پروژه تحقیقاتی علاوه بر بهینه سازی سیستم کشت بافت این گیاه، فرآیند مناسب انتقال ژن به آن نیز مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور اثرات غلظت های مختلف ساکارز و 4 ترکیب متفاوت هورمونی (BAP و NAA) روی القا کالوس، شاخه زایی مستقیم و ریشه زایی در قالب طرح کامل تصادفی به صورت فاکتوریل و با سه تکرار مورد آزمایش قرار گرفت. حساسیت ریزنمونه های توتون به آنتی بیوتیک کانامایسین با کشت ریزنمونه ها روی محیط انتخابی دارای غلظت های مختلف کانامایسین ارزیابی شد. برای انتقال ژن از اگروباکتریوم (Agrobacterium tumefacien) سویه GV3101 حاوی پلاسمید pBI121 استفاده شد و روش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) جهت بررسی گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گرفت. نتایج تجزیه واریانس و مقایسه میانگین نشان داد که بالاترین میزان القا کالوس با استفاده از محیط کشت M1 (حاوی 1/0 میلی گرم در لیتر NAA و 1 میلی گرم در لیتر BAP) با غلظت 15 گرم در لیتر ساکارز حاصل شد. در صورتی که تعداد بالای شاخه زایی مستقیم در محیط کشت M1 با غلظت 30 گرم در لیتر ساکارز بدست آمد. بیشترین فراوانی ریشه زایی نیز توسط 1/0 میلی گرم در لیتر NAA و 60 گرم در لیتر ساکارز حاصل شد. غلظت 50 میلی گرم در لیتر کانامایسین بطور کامل از باززایی نمونه های غیرتراریخته ممانعت کرد و بنابراین از این غلظت در محیط کشت انتخابگر استفاده شد. در نهایت، قطعهbp 798 مربوط به ژن nptII در ژنوم گیاهان تراریخته توتون تایید شد و کارایی تراریختگی با استفاده از روش اگروباکتریوم بیش از 95 درصد محاسبه گردید. تکنیک باززایی مستقیم و انتقال ژن مطرح شده در این تحقیق جهت وارد کردن ژن های خارجی مختلف به ژنوم گیاه توتون بسیار کارا و موثر می باشد.