همسانه سازی و بیان ژن پیلین باکتری Xanthomonas citri subsp. citri

بیماری شانکر باکتریایی مرکبات توسط باکتری Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) ایجاد می شود. سیستم ترشحی نوع سه این باکتری دارای یک ساختار خارج سلولی رشته‏ای است که پروتئین های باکتریایی را به داخل سلول گیاه وارد می کند. پروتئین پیلین (HrpE) جزء اصلی تشکیل دهنده پیلوس می باشد که توسط ژن HrpE کد می‏شود. تولید پادتن اختصاصی علیه پروتئین پیلین می‏تواند به منظور شناسایی گیاهان آلوده و همچنین به عنوان منبع ژنتیکی مقاومت علیه بیماری مورد استفاده قرار گیرد. غیر‏فعال‏سازی پروتئین HrpE با استفاده از پادتن می‏‏تواند منجر به سرکوب بیماری در گیاه شود. هدف از این تحقیق جداسازی و بیان ژن HrpE و خالص‏سازی پروتئین حاصل از آن بود. برای این منظور، قطعه ژنی HrpE با استفاده از آغازگرهای اختصاصی جدا و در ناقل pTZ57R/T همسانه‏سازی شد. بیان این ژن به‏صورت نوترکیب در ناقل pET28a() و در سویه Rosetta باکتری Escherchia coli انجام شد. بهینه‏سازی تولید پروتئین نوترکیب تحت تاثیر زمان‏های مختلف، دمای نگهداری و همچنین غلظت‏های مختلف القا‏کننده مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین مقادیر بیان در دمای 30 درجه سلسیوس و طی زمان 16 ساعت و با IPTG یک میلی‏مولار به‏دست آمد. خالص‏سازی پروتئین نوترکیب HrpE با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی بر روی ستون نیکل صورت پذیرفت. نتایج آزمون‏های الکتروفورز پروتئین و وسترن بلاتینگ با استفاده از پادتن‏های اختصاصی، صحت بیان و خالص‏سازی پروتئین نوترکیب پیلین را مورد تایید قرار دادند. پروتئین نوترکیب تولید شده می‏تواند به عنوان آنتی‏ژن برای تولید پادتن‏های تخصصی تک همسانه‏ای و چند همسانه‏ای مورد استفاده قرار گیرد.