تولید رده سلولی K562 بیان کننده اندونوکلئاز Cas9 (CRISPR-associated9)

 امروزه ژنوم رده های سلولی به منظور ایجاد مدل های بیماری و درمان آن ها ویرایش می شود. البته بزرگی ژن Cas9 موجب مشکلاتی از جمله پایین بودن کارآیی سیستم CRISPR شده است. برای حل این مشکل، رده های سلولی بیان کننده Cas9 تولید شده اند که در آن ها تنها باید بخش RNA راهنمای CRISPR به سلول ترانسفکت شود. در این مطالعه تجربی، قطعه PGK-PURO/CMV (PPC) با PCR از وکتور pAAVS1-puro-DNR تکثیر شده و در وکتور pTG19-Tهمسانه سازی شد. سپس قطعه PPC از این وکتور با آنزیم های KpnI و EcoRI خارج شد. وکتور pCas-Guide-AAVS1 نیز تحت برش آنزیمی مشابه قرار گرفت و اتصال آن با قطعه PPC منجر به ساخت وکتور pPPC-Cas گردید. پس از بهینه کردن شرایط الکتروپوریشن، وکتور pPPC-Cas به درون سلول های K562 الکتروپوریت شد و سلول های مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند و میزان بیان Cas9 در آن ها با Real-time PCR بررسی شد. با PCR قطعه ای به طول 2514 جفت باز تکثیر شد. وکتورpPPC-Cas طی دو مرحله همسانه سازی ساخته شد. سلول های ترانسفکت شده مقاوم به پرومایسین انتخاب شدند. انتخاب کلونی در ادامه انجام شد و سه کلونی که نسبت به هم بیان های بالا، متوسط و پایین داشتند، انتخاب شدند. در این مطالعه سلول های K562 بیان کننده Cas9 به دست آمدند که از آن ها می توان در مطالعه های آتی ژنومیک عملکردی و نیز تولید مدل های سلولی بیماری های انسانی استفاده کرد.