طراحی، ساخت، بیان و تخلیص ژن کدکننده پروتئین کایمر CfaE, CotD از باکتری Enterotoxigenic Escherichia coli

اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک (ETEC) یکی از رایج ترین علل باکتریایی مرگ و میر ناشی از اسهال در کودکان و مسافران کشورهای در حال توسعه می باشد. فاکتورهای کلونیزاسیون ETEC مانند CFA / I و CS2 نقش مهمی در ایجاد بیماری دارند. در این مطالعه برای ساخت پروتئین نوترکیب از همجوش زیرواحد راسی CFA / I (CfaE) و زیر واحد ساختاری CS2 (CotD) از ETEC استفاده شده است. از آن جایی که پاسخ های ایمنی مخاطی روده علیه CF ها می تواند مانع از ایجاد بیماری شود، مطالعه حاضر با هدف تولید آنتی ژن کایمریک به جهت ساخت واکسن موثر علیه باکتری ETEC انجام شد. به منظور تکثیر ژن cfae-cotd، از ساختار ژنی دوگانه متشکل از cfae و cotd، واکنش PCR توسط پرایمرهای طراحی شده انجام شد. ژن تکثیر شده در وکتور بیانی pET28a همسانه سازی شد. در پی القای سازه ژنی نوترکیب با ماده ی IPTG، پروتئین نوترکیب بیان و با ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی، خالص سازی و به وسیله وسترن بلاتینگ توسط Anti-Histag تایید شد. ملاحظات اخلاقی: این مطالعه با کد IR.IAU.SRB.REC.1397.066 در کمیته اخلاق پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران به تصویب رسیده است. صحت همسانه سازی با استفاده از کلونی PCR و واکنش هضم آنزیمی تایید شد. حضور باند در ژل SDS-PAGE 10% در محدوده ی 68 کیلو دالتونی، بیان پروتئین نوترکیب و هم چنین حضور باند بر کاغذ نیتروسلولز در محدوده مذکور در آزمون وسترن بلاتینگ، تاییدی بر تولید پروتئین نوترکیب بود. بهینه سازی کدون و بیان در میزبان های هترولوگ یک روش مفید در تولید پروتئین های نوترکیب است. هم چنین تولید آنتی ژن های ETEC به عنوان کاندید واکسیناسیون بر علیه این باکتری مطرح می باشد.