بهینه سازی توالی ژن رنین گاوی و تهیه سازه ژنی مناسب برای تولید کیموزین در مخمر Pichia pastoris

کیموزین حیوانی به عنوان موثرترین آنزیم برای تولید پنیر مطرح است که این امر به دلیل کیفیت بسیار مناسب بافت و عطر و طعم پنیر تولید شده می باشد. با توجه به تقاضای روز افزون نسبت به این آنزیم نیاز است در کنار سایر منابع گیاهی و میکروبی از منابع نوترکیب نیز برای تولید این آنزیم استفاده گردد. در این پژوهش به منظور تولید نوترکیب کیموزین، و نیز بهبود بیان ژن کیموزین گاوی در مخمر، ابتدا توالی ژن کیموزین بر اساس کاربرد کدونی (Codon usage) مخمر پیچیا پاستوریس بهینه سازی و سنتز گردید. پس از بهینه سازی توالی نوکلئوتیدی، شاخص انطباق کدونی (CAI) از 0/59 به 0/72 افزایش پیدا کرد در حالی که، توالی ژنی 83% با توالی بهینه شده مطابقت داشت. تعداد کدون های نادر با فراوانی کم تر از 10% قبل از بهینه سازی 41 عدد بود که پس از بهینه سازی هیچ کدونی با فراوانی کم تر از 10% یافت نشد. به منظور انتقال ژن کیموزین A به وکتور بیانی pPIC9 مخمری، ژن سنتز شده کیموزین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر و در وکتور PTG-19 همسانه سازی گردید. کلونی‏های نوترکیب از طریق روش غربالگری کلونی های سفید-آبی گزینش شدند. ژن کیموزین با استفاده از آنزیم های Not I و EcoR I از وکتور PTG19-chymA برش داده شده و در وکتور pPIC9 برش یافته با همان آنزیم ها همسانه گردید. کلونی های نوترکیب pPIC9-chymA با استفاده از تکنیک کلونی PCR شناسایی و انتخاب شدند. ماهیت نوترکیبی و درج صحیح ژن کیموزین در وکتور بیانی مخمری pPIC9 از طریق استخراج پلاسمید و برش با آنزیم برشی BamH I مورد تایید قرار گرفت.