تولید موش ناک اوت Spata19 با استفاده از فناوری CRISPR/Cas9

ژن SPATA19 در مراحل تکوینی بیضه و برخی ارگان ها بیان دارد، ولی تاکنون عملکرد آن فقط در بیضه بررسی شده است. در این مطالعه با بهره گیری از روش CRISPR/Cas9 nickase ضمن تولید موش ناک اوت Spata19 برای مطالعات بعدی در سایر ارگان ها، مسیری موثر برای تولید این موش ها ارایه دادیم.

 با استفاده از وکتور pX335 و gRNA های طراحی شده، پلاسمیدهای CRISPR/Cas9 nickase سنتز شدند. هر کدام از پلاسمیدها به باکتری E.coli ترانسفورم شدند و انتخاب کلونال انجام شد. پس از استخراج پلاسمیدها از باکتری، به نسبت مساوی با یکدیگر ترکیب شدند. مخلوط حاصل به پیش هسته ی نر تزریق شد. زیگوت حامل پلاسمید به اویداکت موش فاستر منتقل شد. پس از طی دوران بارداری موش های متولد شده مورد آنالیز قرار گرفتند.

 با استفاده از روش CRISPR/Cas9 nickase موش های ناک اوت با حذف 2 نوکلیوتیدی ایجاد کردیم. این حذف در سه سطح DNA، RNA و پروتئین مورد بررسی قرار گرفت. حذف 2 نوکلیوتیدی در سطح DNA و RNA به وسیله توالی یابی تایید شد. با ترجمه ی توالی RNA جهش یافته مشخص شده که این حذف کدون خاتمه زودرس ایجاد می کند. در بررسی فنوتیپی نیز عقیم بودن موش های هموزیگوت نر (Spata19-/-) تایید شد.

 با تولید موش های ناک اوت Spata19 ما یک پروتکل برای تولید موش های ناک اوت ارایه می دهیم. این موش ها می تواند به عنوان موش های نابارور و برای بررسی ویژگی های بیش تر ژن Spata19 به کار گرفته شود.