شناسایی ژن مربوط به آنزیم P450 مسئول تولید آلکالوئید کیلانتیفولین درگیاه .Chelidonium majus L با استفاده از مخمر مهندسی ژنتیک شده Pichia pastoris

گیاهان منشا اصلی تولید متابولیت های ثانویه با ارزش دارویی بالا می باشند. مهمترین عضو این ترکیب های با ارزش، آلکالوییدها با مصارف مختلف دارویی هستند. با توجه به تولید محدود برخی از این مواد در گیاهان، به عنوان روش جایگزین، با شناسایی و انتقال ژن های مسیول سنتز آنزیم های سازنده آلکالوییدها از گیاهان به میکروارگانیسم ها می توان به صورت تجاری این گونه از مواد دارویی را به صورت طبیعی تولید کرد. در این راه، شناسایی ژن های مسیول آنزیم های سنتزکننده قدم نخست چنین اقدامی است. در بین آنزیم های سنتزکننده ترکیب های آلکالوییدی، آنزیم های سیتوکروم P450 نقش مهمی دارند. با توجه به وابستگی این آنزیم ها به وجود شبکه اندوپلاسمی و خصوصیات گلیکوپروتیینی این آنزیم ها، نمی توان آنها را در سیستم های باکتریایی استاندارد بیان کرد. بنابراین می توان از میزبان های یوکاریوتی مانند مخمر یا سلول حشرات برای بیان آنها استفاده کرد. در این تحقیق، با استفاده از توالی آمینو اسیدی شناخته شده کیلانتیفولین سنتاز گیاه شقایق کالیفرنیایی و مقایسه فیلوژنی این توالی با توالی های آمینو اسیدی هومولوگ گیاه مامیران بدست آمده از پایگاه داده بیوانفورماتیک، به صورت نظری شش آنزیم سیتوکروم P450 با درصد هومولوژی بالا مسیول سنتز آنزیم کیلانتیفولین سنتاز در گیاه مامیران (Chelidonium majaus L.) شناسایی شد. برای اثبات عملی کارآیی این آنزیم ها، ژن های آنها در وکتور pPIC3.5 کلون شده و بعد با انتقال این وکتورهای نوترکیب به سلول مخمر Pichia pastoris و در اختیار قرار دادن آلکالویید اسکولریین، تولید آلکالویید کیلانتیفولین توسط میکروب های انتقال ژن داده شده توسط دستگاه LC-MS بررسی گردید. نتایج نشان داد که از بین ژن های کلون و معرفی شده آن آنزیم ها به میزبان مخمر، تنها آنزیم Contig8931 فعالیت کیلانتیفولین سنتازی دارد.