آنالیز آرایش سه موتاسیون هتروزیگوت در ژن CYP3A4 انسانی با فواصل طولانی از هم

این کار به منظور پی بردن به نحوه آرایش موتاسیون های هتروزیگوت مکشوفه در حین آنالیز ژن CYP3A4 (جایگزینی 9 bp در موقعیت 845-، جابجایی A?G در موقعیت 392 – و G?A در موقعیت 14269+) در allele های احتمالی انجام گرفته است.
در ابتدا ناحیه پرومتور نزدیک ژن CYP3A4 (61-/1201-) که دو تا از سه موتاسیون در آنجا قرار داشتند با PCR تکثیر، سپس با استفاده از پلاسمید pSEAP2 – Basic (Clontech) کلون و در مرحله بعد توالی آن (با PCR قطعه مزبور و تعیین توالی آن در پلاسمید) مشخص گردید. برای تعیین ارتباط این موتاسیون ها با موتاسیون سوم که در فاصله 15 kb از آنها و در اکسون 6 ناحیه کد کننده ژن قرار داشت از تکنیک long – range allele – specific استفاده شد. دو محصول بلند PCR بدست آمده (از bp 858 – در ناحیه پروموتور تا انتهای اکسون 6) که یکی از حامل موتاسیون ها و دیگری فاقد آنها بود پس از استخراج از ژل و خالص سازی، به عنوان الگو برای PCR مجدد اکسون 6 بکار گرفته شد. با تعیین توالی محصولات PCR نهایی، این مساله که موتاسیون اکسون 6 در کدام allele واقع است، معلوم گردید.
در مرحله اول با انجام PCR و کلون کردن ناحیه پروموتور معلوم گردید که دو موتاسیون مربوط به این ناحیه در ارتباط با یکدیگر و در روی یک allele قرار دارند. در مرحله بعدی نیز ارتباط و وابستگی این موتاسیون ها با موتاسیون اکسون 6 ژن مشخص شد و در نتیجه allele جدیدی از ژن CYP3A4 تحت عنوان CYP3A4*158 معرفی گردید.
این تجربیات امکان استفاده از تکنیک long – range allele – specific PCR برای تعیین ارتباط allelic موتاسیون های هتروزیگوت با فواصل طولانی از هم را بخوبی نشان داده و توسعه آنالیز وسیعتر و دقیقتر ژنتیکی را نوید می دهد.