کلونینگ و بیان ژن K26 لیشمانیا در E.coli و ارزیابی پتانسیل آن

هدف این مطالعه تهیه آنتی ژن k26 لیشمانیا اینفانتوم بصورت نوترکیب جهت کاربرد آن در تشخیص سرولوژیک لیشمانیوز احشایی بود.
لیشمانیااینفانتوم سویه بومی ایران کشت داده شده و DNA ژنومی آن استخراج و در واکنش زنجیره ای پلیمراز برای تکثیر قطعه ژن k26 مورد استفاه قرار گرفت. محصول PCR تخلیص گردیده در حامل pBluescript کلون گردید. کلونهای مثبت از طریق تهیه نقشه برشی و تعیین توالی تایید گردیدند. جهت بیان ژن k26 در باکتری E.coli، ژن کلون شده از طریق هضم آن از حامل pBluescript جدا گردیده و در حامل pQE-80L ساب گردید. سازه حاصل سپس در باکتری E.coli سویه DH5a ترانسفورم گردیده تولید پروتئین نوترکیب از طریق افزودنIsopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) القا گردید. نهایتا پروتئین k26 نوترکیب با استفاده از ستون جدایی نیکل (Ni-NTA) تخلیص گردیده و برای بررسی پاسخ بیماران با روش وسترن بلاتینگ مورد استفاده قرار گرفت.
واکنش زنجیره ای پلیمراز روی DNA لیشمانیا اینفانتوم با پرایمرهای طراحی شده براساس ژن k26 لیشمانیا شاگاسی موجب تکثیر قطعه ای با اندازه 756 جفت باز گردید. قطعه تکثیر شده در حامل pBluescript کلون گردیده و تهیه نقشه برشی و تعیین توالی صحت کلونهای بدست آمده با تایید نمودند. بررسی تشابه توالی ژن کلون شده با توالی های موجود در بانکهای ژنی نشان داد که ژن k26 لیشمانیا دارای 98% هومولوژی با ژن k26 لیشمانیا شاگاسی و 95% همولوژی با ژن k26 لیشمانیا دونووانی می باشد. بیان ژن کلون شده در E.coli با استفاده از حامل pQE-80L بیماران مبتلا به لیشمانیوز احشایی با پروتئین نوترکیب تخلیص شده با روش ایمونوبالتینگ نشان داد که سرم بیماران دارای تیتر بالایی از آنتی بادی علیه آنتی ژن k26 هستند.
نتایج این مطالعه نشان میدهد که آنتی ژن k26 نوترکیب تهیه شده از حساسیت و ویژگی بالایی برای شناسایی عفونت با لیشمانیا اینفانتوم برخوردار بوده و لذا این آنت موجب تولید پروتئین نوترکیب k26 در مقادیر بالا گردید که بصورت باند غلیظی در نمونه های پس از القا در ژل SDS-PAGE نمایان گردید. بررسی واکنش سرمی ژن میتواند برای تشخیص سرولوژیک لیشمانیوز احشایی مورد استفاده قرار گیرد.