شناسائی ژن شیگاتوکسین به وسیله روش Multiplex PCR

زیر گونه های Shiga toxin– producing E. coli) STEC) و بیوتایپ 1 شیگلا دیسانتری باعث ایجاد اسهال، کولیت هموراژیک و ناهنجاری های بدخیم سیستم مجاری ادراری HUS (Hemolytic Uremic Syndrome) در انسان می شوند. بسیاری از نشانه های کل ی نیکی این بیماری در اثر تولید شیگا توکسین 1(Stx /Stx1)، شیگا توکسین 2 (Stx2) و یا مجموعه ای از هر دو نوع توکسین پدید می آید. این تحقیق جهت شناسای ی ژن این توکسین ها به وسیله روش ملکولی صورت گرفته است.

برای شناسای ی ژن های stx/stx1 و stx2 تکنیکی براساس Multiplex PCR به همراه ژن مالات دهیدروژناز (mdh) موجود در دو باکتری E. coli و شیگلا طراحی شده است. مجموعه ای از 6 پرایمر استفاده شده است: SFI و SRI یک قطعه bp 199 از ژن mdh را تولید می کنند که به عنوان یک کنترل مثبت (Internal positive control) برای صحت واکنش عمل می کند، Ka2R و Ka2F یک قطعه pb 381 از ژن stx2 را تولید و Ka1F و Ka1R یک قطعه pb 622 از ژن stx/stx1 را تولید کنن د. جهت تایید محصولات واکنش از فرآیند هضم آنزیمی و تعیین توالی استفاده شد.

محصولات PCR ژن های stx/stx1 و stx2 و mdh تنها در E. coli O157:H7 به طور هم زمان مشاهده شد و در بیوتایپ 1 شیگلا دیسانتری تنها قطعه مربوط به stx/stx1 و mdh مشاهده گردید. در ژنوم تخلیص شده از دیگر باکتری های گرم منفی قطعات مربوط به توکسین مشاهده نشد. فرآیند هضم آنزیمی و تعیین توالی صحت قطعات تکثیر شده را مورد تایید قرار داد. حساسیت واکنش PCR برای شناسای ی ژن شیگا توکسین pg/ m l 1/2 از ژنوم باکتری و معادل cfu/ m l 320 بود.

واکنش طراحی شده قادر به شناسای ی ژن های stx2، stx/stx1 و mdh می باشد. E. coli O157:H7 قادر به تولید هر دو نوع شیگا توکسین و بیوتیپ 1 شیگلا دیسانتری تنها قادر به تولید نوع 1 شیگا توکسین می باشند. با بررسی های انجام شده بر روی قطعات تکثیر شده و مقایسه آن ها با بانک ژنوم مشخص شد که قطعه در نظر گرفته شده برای تکثیر stx2 در تمامی انواع این ژن وجود دارد، در نتیجه جهت شناسایی آن ها مناسب می باشد. این روش وسیله ای مناسب جهت تشخیص انواع شیگا توکسین ها می باشد چرا که سریع، اختصاصی، حساس و ارزان می باشد.