طراحی آزمون زنجیره ای پلی مراز (PCR) جهت تشخیص مولکولی سریع Neisseria meningitidis

نایسریا مننژیتیدیس پاتوژن اختصاصی انسان و دومین عامل شایع مننژیت در جهان است. جهت شناسایی این باکتری از آزمون های سنتی مانند کشت مایع نخاعی استفاده می شود ولی از معایب این روش ها وقت گیر بودن است. هدف این مطالعه، تشخیص سریع این باکتری به روش واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) با استفاده از ژن CrgA است.

ژن اختصاصی، حفاظت شده و دارای ارزش تشخیصی CrgA جهت طراحی پرایمر انتخاب گردید. پرایمرهای اختصاصی برای این ژن طراحی شد. واکنش PCR توسط این پرایمرها بر روی DNA ژنومیک نایسریا مننژیتیدیس راه اندازی شد. جهت ساخت کنترل مثبت، محصول PCR در وکتور pTZ57R/T کلون گردید. جهت تایید حضور ژن هدف در وکتور، روش هضم آنزیمی و توالی یابی انجام شد. به منظور تعیین حساسیت واکنش، از پلاسمید کنترل مثبت فوق با غلظت اولیه 70 نانوگرم رقت 5-10- 1-10 تهیه گردید و واکنش PCR ژن هدف بر روی همه رقت های پلاسمید انجام گرفت. تعیین ویژگی واکنش، بر روی 11 ژنوم از باکتری های مختلف انجام شد.

نتایج PCR ژن CrgA باند مورد انتظار 500 جفت باز را نشان داد. نتایج حاصل از هضم آنزیمی و توالی یابی، حضور ژن هدف را در وکتور تایید کرد. حد نهایی تشخیص این روش برای ژن Crg A، 70 پیکوگرم به دست آمد. نتایج تعیین ویژگی مشخص نمود که پرایمر طراحی شده با هیچ یک از باکتری های دیگر واکنش تکثیر غیر اختصاصی ندارد.

روش PCR طراحی شده در این تحقیق از دقت و حساسیت لازم برخوردار است به طوری که از این روش می توان به عنوان یک آزمون قابل اعتماد، جهت تشخیص سریع باکتری نایسریا مننژیتیدیس استفاده نمود.