Cell Journal (Yakhteh)
Volume:5 Issue: 3, 2003

تولید آنتی بادی مونوکلونال علیه آنزیم آلکالین فسفاتاز به منظور استفاده در روش های ایمونوهیستوشیمی و ایمونوسیتوشیمی مثل روش آلکالین فسفاتاز - آنتی آلکالین فسفاتاز.(APAAP) در این پژوهش ابتدا خموشهای Balb/c ماده تحت تزریقات منظم آنزیم آلکالین فسفاتاز قرار گرفتند و تیتر آنتی بادی تولید شده پس از هر تزریق مورد بررسی قرار گرفت. پس از اطمینان از ایمن شدن موشها بین لنفوسیتهای طحالی آنها و سلولهای میلومای Sp2/0 با کمک پلی اتیلن گلیکول PEG)، 50درصد) امتزاج برقرار شد و هیبریدوماهای تولید شده به کمک محیط انتخابی HAT جداسازی شدند. بر روی مایع رویی تمام کلونهای هیبریدومایی تشکیل شده، آزمون الایزا انجام گرفت تا کلونهای مولد آنتی بادی علیه آلکالین فسفاتاز شناسایی و انتخاب شوند. کلونهای تولید کننده آنتی بادی با کمک روش آخرین حد رقت (Limiting Dilution) (دو مرتبه) به صورت زیر کلون خالص در آمده و توسعه یافتند. چون پس از تشکیل کمپلکس APAAP، فعالیت آنزیمی باید حفظ شود تا بتوان از این کمپلکس در تکنیکهای ایمونوهیستوشیمی بهره برد، لذا اتصال آنتی بادی نباید باعث توقف فعالیت آنزیمی گردد. به منظور بررسی این موضوع، آزمایش الایزایی طراحی شده و مایع رویی کشت کلونهای هیبریدومایی انتخاب شده، توسط روش الایزای مذکور، بررسی شد. در مرحله بعد جهت تولید آنتی بادی با غلظت زیاد، هیبریدوماها به صفاق موش تزریق شدند و پس از تشکیل تومور، مایع صفاقی جمع آوری گردید. نهایتا آنتی بادی های تولیدی توسط هیبریدوماهای به دست آمده تعیین ایزوتیپ شدند.
در 6 بار فیوژن، 104 کلون هیبریدومائی بدست آمد که از این تعداد، 2 کلون A1G8 و A1G9 که مولد آنتی بادی اختصاصی و واجد جذب بالا در آزمایش الایزا بودند، انتخاب شد. پس از اجرای روش آخرین حد رقت نهایتا دو زیر کلون A1G8F7 که بصورت تک کلون درآمده بودند انتخاب گشتند. آزمایشات الایزا نشان داد که آنتی بادی های تولیدی توسط هیبریدوماهای بدست آمده پس از اتصال به آنزیم، تاثیری بر فعالیت آن نگذاشته و به عبارت دیگر به ناحیه فعال آنزیم متصل نمی شوند. نتایج الکتروفورز مایع صفاقی موشهایی، که در آنها به وسیله هیبریدوماهای تولیدی، القاء تومور شده بود، باند پروتئینی مشخصی در ناحیه Y را نشان داد. آزمایشات مربوط به تعیین کلاس و زیر کلاس آنتی بادی های تولید شده توسط کلونهای هیبریدومایی نشان دادک که هر دو آنتی بادی مذکور از کلاسIgG، زیر کلاس IgG1 و دارای زنجیره سبک K هستند.
چون آنتی بادی های تولید شده توسط کلونهای هیبریدومایی بدست آمده. از کلاس IgG بوده و روی فعالیت آنزیمی نیز تاثیری ندارند. لذا برای تشکیل کمپلس APAAP مناسب به نظر می رسند. سایر مراحل این پژوهش تا تشکیل این کمپلکس و استفاده عملی از آن در تکنیکهای ایمونوهیستوشیمی در حال انجام است.

بررسی نقش گیرنده های آدنوزیتی A1 آمیگدال بر تشنجهای ناشی از کیندلینگ قشر انتورینال به کمک استریوتاکسی یک الکترود سه قطبی در قشر انتورینال حیوانات کار گذاشته شد. حیوانات با تحریک روزانه قشر انتورینال، کیندل شدند و از طریق یک کانول راهنما، آگونیست اختصاصی گیرنده آدنوزینی A1، n6-سیکلوهگزیل آدنوزین (CHA)، با غلظت های 10، 50، 100 و 500 میکرومولار و آنتاگونیست اختصاصی گیرنده آدنوزینی A1 و 8-سیکلوپنتیل-3، 1-دی متیل گزانتین (CPT)، با غلظت های 10 و 20 میکرومولار به داخل آمیگدال تزریق شد.
CHA فقط با غلظت 500 میکرومولار در زمان 15 دقیقه پس از تزریق باعث کاهش معنی دار امواج تخلیه متعاقب انتورینال، امواج تخلیه متعاقب آمیگدال، مدت زمان مرحله 5 تشنج و طول دوره تشنج و افزایش معنی دار در زمان تاخیری بین تحریک و شروع مرحله 4 تشنج شد. تزریق غلظت 20 میکرومولار به داخل آمیگدال، زمان تاخیری بین تحریک و شروع مرحله 4 تشنج را در زمان 15 دقیقه پس از تزریق به طور معنی داری کاهش داد. ولی CPT با غلظت 10 میکرومولار هیچ تاثیر معنی داری بر کمیت های تشنجی نداشت. پیش درمانی حیوانات با (10? m) CPT، اثرات (500? m) CHA بر کمیتهای تشنجی را حذف نمود.
نتایج حاصله پیشنهاد می کند که آمیگدال ممکن است در گسترش امواج تشنجی از قشر انتورینال به سایر نواحی نقش داشته و فعالیت گیرنده های آدنوزینی A1 این ناحیه در ایجاد اثرات ضد تشنجی مؤثر باشد.

بررسی سلولهای کشت یافته اپی تلیال رحم انسانی روی ماتریکس برون سلولی و پلاستیک Polstyene در مقایسه با سلولهای اپی تلیال بافت رحم.
آندومتر رحم انسان، تهیه شده از نمونه های هیسترکتومی، به دو قطعه تقسیم گردید. یک قطعه برای مطالعه (Transmission Electron Microscopy) TEMو قطعه دیگر برای کشت استفاده شد. با استفاده از آنزیم کلاژناز نوع (25/0 درصد) سلولهای از بافت جدا گردیده و در فلاسک پلاستیکی کشت داده شدند (کشت غیر قطبی). برای تعیین نوع سلول در کشت اولیه از رنگ آمیزی با آنتی سایتوکراتین 7 استفاده شد. 5 روز پس از کشت، با استفاده از آنزیم 05/0 درصد تریپسین در محلول 53 میلی مولار EDTA، سلولهای کف پلاستیک جدا و روی ژل (Extracellular Matrix) ECM کشت داده شدند (کشت قطبی). بعد از چند روز جزایر سلولهای قطبی ظاهر گردید. سلولهای کشت یافته روی پلاستیک و ژل ECM و نیز بافت آندومتریوم برای مطالعه TEM پاساژ داده شدند.
نتایج رنگ آمیزی نشان داد که سلولها در کشت اولیه ماهیت اپی تلیالی دارند. تصاویر میکروسکوپ الکترونی سلولهای پوششی آندومتر کشت یافته روی پلاستیک نشان داد که این سلولها بر خلاف حالت In vivo کم ارتفاع، دوکی شکل و کشیده بوده، هسته قسمت اعظم سلول را تشکیل می دهد.سیتوپلاسم اندک، تعداد کم میتوکندری و (Rough Endoplasmic Reticulum) rER و وجود واکوئل از دیگر ویژگی های این سلولها است. بین سلولها اتصال محکم که یکی از نشانه های مهم قطبیت سلول در سطح فرا ساختاری است مشاهده نشد. تصاویر سلولهای کشت یافته روی ژل ECM نشان داد که این سلولها همانند حالت In vivo استوانه ای با هسته هایی عمدتا در بخش قاعده ای هستند. سلولها توسط اتصال محکم و دسموزوم به هم دیگر بسته شده اند، این سلولها بر خلاف حالت In vivo هسته کاملا یوکروماتینی داشته و از ناحیه غشاء جانبی پنجه در پنجه می شوند.
سلولهای اپی تلیال اندومتریوم انسان، زمانی که بر پلاستیک کشت می شوند خصوصیات مرفولوژیک خود را از دست می دهند و غیر قطبی می شوند. همین سلولها، پس از جدا شدن از سطح پلاستیک و کشت روی ECM خصوصیات مرفولوژیک از دست رفته را باز می یابند و کاملا قطبی می شوند.

ارزیابی خاصیت پرتوانی(Pluriportency) سلولهای بنیادی جنینی موش و تمایز آنها به سلولهای عصبی.
از سلولهای بنیادی جنین موش نژاد C57BL/6 تولید شده در آزمایشگاه موسوم به (رویان B1)، برای تولید سلولهای عصبی استفاده شد. بدین منظور از سلولهای رویان B1 اجسام شبه جنینی (Embryoid bodies) ساخته شد و به دنبال آن سلولهای پیشاز عصبی به واسطه فاکتورهای رشد اپیدرمی و فیبروبلاستی (bFGF, EGF) انتخاب شدند. سلولهای حاصل با حذف فاکتورهای رشد و کشت در محیطهای مناسب به سلولهای عصبی و گلیال تمایز یافتند. برای ارزیابی نورونهای تولید شده در محیط آزمایشگاه به غیر از مورفولوژی از آزمونهای ایمونوهیستوشیمی و الکتروفیزیولوژی استفاده شد.
مطالعات ایمونوهیستوشیمی با آنتی بادی علیه (Microtubule Associated Protein-2) MAP-2، آنزیم (Tyrosine Hydroxylase) TH؛ (Glutamic Acid Decarboxylase) GAD نشان داد ه سلول های حاصل، نورون بوده و دارای جمعیتی از نورون های مولد GABA و دوپامین هستند.
مطالعات الکتروفیزیولوژی نیز نشان داد، سلولهای مزبور پتانسیل عمل را به طور خود به خود تولید می کنند و نسبت به تحریکات الکتریکی نیز واکنش نشان می دهند.
نتایج نشان داد: سلولهای بنیادی جنینی رویان B1 قابلیت تولید نورون را داشته و نورونهای تمایز یافته در محیط آزمایشگاهی دارای عملکرد هستند.

تبیین مکانیزم های دخیل در تکوین تحمل به مواد اپیوییدی، با بررسی تغییرات احتمالی بیان ژن پروتئین های Gαi/o وGβ در ایجاد تحمل به اثر ضد دردی اپیوییدها هنگام مصرف مزمن مرفین از دوز 20 میلی گرم بر کیلوگرم مرفین به شدت 4 روز برای ایجاد تحمل استفاده شد.RNA کل با کمک محلول RNX به توان مثبت، به روش کلروفوم - الکل استخراج، و در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری شد. برای سنتز cDNA از پرایمر Oligo-dT و آنزیم نسخه برداری معکوس M-MulV استفاده شد. بخشی از cDNA مربوط به پروتئین های بتا - اکتین Gαi/o و Gβ با استفاده از پرایمرهای اختصاصی توسط PCR تکثیر شدند. (Semi-quantitative PCR) دانسیته باند حاصل از الکتروفورز مربوط به پروتئین های Gαi/o و Gβ نسبت به بتا-اکتین برای هر نمونه محاسبه و با گروه کنترل مقایسه شد.
ایجاد تحمل با مصرف مزمن مرفین به مدت 4 روز، اثر بارزی بر میزان بیان ژن پروتئین Gαi/o نداشت ولی باعث افزایش معنی دار میزان بیان ژن پروتئینGβ گردید. (P<0.05) یافته ها نشان داد که مصرف مزمن مرفین با دوز مذکور که قادر به ایجاد تحمل اثر ضد دردی اپیوییدها می باشد، اثری بر میزان بیان ژن پروتئین های Gαi/o ندارد، اما احتمالا بخشی از روند ایجاد تحمل را بر افزایش بیان پروتئین Gβ باعث می شود و احتمالا این پروتئین از طریق افزایش فعالیت آدنیلیل سیکلاز این عمل را موجب می شود.

ارزیابی اثر فعال سازی به روش الکتریکی، بر میزان لقاح و تکوین، بعد از تزریق داخل سیتوپلاسمی اسپرم در بیماران تراتواسپرمی تعداد 168 تخمک حاصل از تزریق درون سیتوپلاسمی 13 بیمار که همسرانشان مبتلا به تراتوسپرمی شدید بودند، بعد از تزریق به دو گروه کنترل و فعال شده الکتریکی (گروه تجربی) تقسیم شدند. فعال سازی تخمک ها به دنبال تزریق درون سیتوپلاسمی اسپرمها، به وسیله دستگاه الکتروفیوژن مدل (Biological Laboratory service, H-1165. Hungary; CF-150B) CF-150B با جریان مستقیم 2/2 کیلو ولت بر سانتیمتر و زمان 50? s انجام شد.
میزان لقاح بعد از انجام تزریق داخل سیتوپلاسمی اسپرمها در گروه کنترل (42 درصد) و فعال شده الکتریکی (71 درصد) اختلاف معنی دار دارد. (P=0.04) از طرفی بین دو گروه از لحاظ میزان تکوین اختلاف معنی داری، 66 ساعت بعد از تزریق داخل سیتوپلاسمی اسپرم وجود ندارد (P>0.176) اما بین میزان درصد 8 سلولی نسبت به تعداد کل تخمکهای تزریق شده در گروه کنترل (15 درصد) و فعال شده الکتریکی (50 درصد) اختلاف معنی داری وجود دارد.(P=0.009) به نظر می رسد انجام فعال سازی به روش الکتریکی، 30 دقیقه بعد از تزریق درون سیتوپلاسمی اسپرم، در بیماران تراتواسپرمی می شدید، تا حدودی می تواند موجب افزایش لقاح و بهبود تکوین جنین شود.

ارایه سلول مناسب برای چسبندگی هلیکوباکترپیلوری و روش مناسب برای بررسی چسبندگی هلیکوباکترپیلوری به سلولها در شرایط آزمایشگاه 22 سوش هلیکوباکترپیلوری از بیوپسی انتر معده یا دوازدهه 49 بیمار با علایم دیس پیسی، گاستریت، زخم معده، زخم اثنی عشر و... جدا شد، با استفاده از فعالیت اوره آزی هلیکوباکترپیلوری (Urea Phenol Red) UPR چسبندگی به هفت رده سلول انسانی از طریق روشELISA بررسی شد. با مقایسه روش های گزارش شده. ادغام و یا تغییر در آنها از نظر نوع سلول، غلظت شیرابه سلولی و باکتری، دما و مدت زمان تماس مجاورت باکتری و سلول روش مناسب و بهترین سلول برای مقایسه چسبیدن هلیکوباکتر به سلولها بدست آمد.
هلیکوباکترپیلوری به تمام هفت رده سلولی استفاده شده در in vitro می چسبد و چسبندگی به سلولهای به ترتیب از HT29, HT29/219, AGS,SW42, HeLa, Hepll تا Caco کاهش قابل ملاحظه ای را نشان می دهد بهترین چسبندگی به سه رده سلول اول بود. استفاده از غلظت شیرابه میکروبی معادل لوله 1 مک فارلند برای هلیکوباکترپیلوری و شیرابه سلولی حاوی 104×5 سلول در میلی لیتر، زمان 90 دقیقه مجاورت باکتری با سلول در 37 درجه سانتیگراد منجر به حداکثر چسبندگی شد. بین 22 سوش هلیکوباکترپیلوری از نظر چسبیدن به سلولهای تفاوت معنی داری وجود نداشت.
برای بررسی های چسبندگی(Attachment)، ممانعت از چسبندگی (inhibition of attachment) جداسازی (Detachment) استفاده از روش چسبندگی ارایه شده در این تحقیق توصیه می شود و از بین هفت رده سلول آزمایش شده، سلول Hepll بعنوان سلول مناسب برای استفاده در این گونه تحقیقات پیشنهاد می گردد.

مطالعه اثر هورمونهای FSH و تستوسترون بر بلوغ سلولهای اسپرماتید گرد تازه (fresh) و منجمد - ذوب شده برای این منظور سوسپانسیون سلولی از بیضه موش نژاد NMRI(با سن 8-10 هفته) تهیه شد و به دو قسمت تقسیم گردید. بخشی از سوسپانسیون سلولی جهت استفاده به صورت تازه اختصاص داده شد. بخش دوم از آن با ترکیب ضدیخ (W/V)، 18 درصد رافینوز و (W/V)، 3 درصد شیرخشک در آب مقطر، با روش انجماد سریع منجمد گردید. از این دو بخش جهت کشت سلولی به مدت 96 ساعت استفاده شد و نتایج حاصل با میکروسکوپ نوری بررسی و ثبت شد. همچنین میزان درصد زنده ماندن انواع سلولهای اسپرماتید در دوره ذکر شده با رنگ آمیزی حیاتی تریپان بلو ارزیابی شد.
نتایج این تحقیق نشان داد که در نمونه های تازه ای (fresh) که در محیط کشت حاوی هورمون کشت شده بودند بعد از 24 ساعت تعداد سلولهای اسپرماتید گرد کاهش یافته و بر تعداد سلولهای اسپرماتید elongating و elongated افزوده شد ولی نمونه های منجمد - ذوب شده ای که در محیط حاوی هورمون کشت شده بودند علی رغم کاهش شدید تعداد سلولهای اسپرماتید گرد به دلیل آسیب ناشی از انجماد، تعداد سلولهای اسپرماتید elongating و elongated افزایشی نشان نداده ولی تعداد آنها در ساعت اولیه کشت حفظ شد.
این اطلاعات نشان می دهد که اسپرماتیدهای گرد در محیط کشت حاوی هورمون در نمونه های تازه و منجمد - ذوب شده فقط در 24 ساعت اولیه کشت قادر به پیشرفت بلوغی هستند.