Cell Journal (Yakhteh)
Volume:4 Issue: 1, 2002

ایزوله های مختلف ژیاردیای انسانی، که تحت عنوان ژیاردیا اینتستینالیس (Giardia intestinalis) می شناسیم، در حساسیت به دارو، الگوهای ایزو آنزیم، بیماریزایی و عفونت زایی، آنتی ژنها و الگوی برش آنزیمی متفاوتند. هدف از این بررسی، تعیین ایزوله های ژیاردیا با روش PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Lenght Polymorphism) است.
در این بررسی بر روی DNA استخراج شده از تروفوزویین های به دست آمده از محیط کشت TYIS-33 تغییر داده شده با دو جفت پرایمر که بر اساس سکانس ژن آنزیم تریوزفسفات ایزومراز انگل ژیاردیا طراحی شده بودند واکنش PCR انجام گرفت. محصول PCR پرایمرها 683 bp و 812 bp بود که برای افتراق سویه ها از اختلاف برش آنزیمی آنها با آنزیم NcoI استفاده شد.
الگوی RFLP ایزوله های ژیاردیا اینتستینالیس برای پرایمرهای I دو قطعه 419 bp و 264 bp و برای پرایمرهای II دو قطعه 228 bpو583 bp می باشد. برای اطمینان از صحت باندهای فوق از مارکر DNA، 100 bp استفاده گردید.
با استفاده از روش PCR-RFLP می توان به طور اولیه، برخی از ایزوله های ژیاردیای جدا شده از انسان را تعیین نمود.

لیستریا مونوسیتوژنز، باکتری گرم مثبتی است که در محیط اطراف یافت می شود و عامل بیماری های شدیدی نظیر عفونت های قبل و بعد از تولد، سپتی سمی و مننژیت در انسان و حیوان می باشد. وجود ژن ctpA (ژن انتقال دهنده مس) در عفونت های ناشی از لیستریامونوسیتوژنز در انسان اهمیت دارد. هدف از این بررسی، یافتن ژن ctpA در لیستریا مونوسیتوژنزهای جدا شده از منابع گوناگون، تعیین شرایط مناسب برای انجام PCR و یافتن روشی برای انتقال ژن ctpA به درون باکتری اشریشیاکلی در دانشگاه آدلاید استرالیا بوده است.
این تحقیق در دو مرحله)مرحله اول، یافتن ctpA در 69 سویه لیستریا مونوسیتوژنز نگهداری شده در آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آدلاید و در مرحله دوم انتقال این ژن به باکتری (E.coli DH5-α) انجام گرفته است. ابتدا، DNA از کروموزوم لیستریا مونوسیتوژنز جدا شده و سپس با استفاده از PCR و الکتروفورز، وجود ژن ctpA در آن جستجو، جدا و در روی ژل اگاروز با فنل خالص گردید. بعد این ژن به درون پلاسمید PGEM-T اتصال داده شد و به سلولهای گیرنده از E.coli DH5-α وارد گردید. کلنی های سفید رنگی که در محیط کشت حاوی X-gal ظاهر شدند حاوی ژن ctpA بودند. پس از خالص کردن این ژن در روی ژل آگاروز، با استفاده از dye-terminator و خالص سازی ژن، توالی کامل نوکلئوتیدی از DNA کلون شده تعیین گردید.
از 69 لیستریا مونوسیتوژنز مورد بررسی، 38 درصد آنها دارای ژن ctpA بودند. ctpA از 90 درصد از نمونه های کلینیکی و لبنیات، 85 درصد از نمونه های محیطی و 7 درصد از نمونه های حاصل از گوشت و مرغ به دست آمد. با توجه به مشکلاتی که در انجام انتقال ژنها وجود دارد، خوشبختانه در این روش، توالی های نوکلئوتیدی ژن ctpA از لیستریا مونوسیتوژنز به درون اشریشیاکلی با موفقیت انجام شد.
چون ژن ctpA در 90 درصد از لیستریا مونوسیتوژنز های به دست آمده از لبنیات و نمونه های کلینیکی یافت شد و در 7 درصد از لیستریا مونوسیتوژنزهای به دست آمده از مرغ و خروس مشاهده گردید، این امر احتمالا نشان دهنده آن است که نژادهای مختلف این باکتری ها، خاصیت بیماریزایی یکسانی ندارند. با توجه به اینکه، این باکتری در درون سلول قادر به تکثیر می باشد، بنابراین با انتقال این ژن به درون اشریشیاکلی، شاید بتوان از اشریشیاکلی حاوی این ژن جهت تهیه واکسن در برابر عفونت های لیستریا مونوسیتوژنز استفاده نمود

تشخیص افتراقی انتامبا هیستولیتیکا (بیماریزا) و انتامبا دیسپار (غیر بیماریزا) جدا شده در تهران و نشان دادن اختلاف آنها با استفاده از روش (Polymerase Chain Reaction Restriction) PCR-RFLP Fragment Length Polymorphism در این بررسی، بر اساس سکانس ژن کد کننده آنتی ژن سطحی 30 کیلودالتونی انتامبا هیستولیتیکا/ انتامبا دیسپار یک جفت پرایمر طراحی شد و با استفاده از روش واکنش زنجیره پلی مراز (PCR) یک قطعه 374 جفت نوکلئوتیدی (bp) از DNA ژنومی تکثیر گردید. برای افتراق این دو گونه آمیب از اختلاف برش آنزیمی محصول PCR با آنزیم Hinfl و مقایسه آن با ایزوله های استاندارد استفاده شد.
الگوی RFLP ایزوله های استاندارد انتامبا هیستولیتیکا دو باند 219 bp و 155 bp و در انتامبا دیسپار 3 باند 155 bp و 152 bp و 67 bp را نشان داد. با انجام این روش بر روی 8 ایزوله جدا شده در تهران همگی الگوی انتامبا دیسپار 3) باند 155 bp و 152 bp و (67 bp را نشان دادند.
تشخیص افتراقی انتامبا هیستولیتیکا و انتامبا دیسپار از لحاظ بالینی و اپیدمیولوژی دارای اهمیت زیادی می باشند. این دو آمیب از نظر مرفولوژی غیر قابل افتراق هستند اما روش های مبتنی بر PCR می توانند برای تشخیص دقیق این دو آمیب مورد استفاده قرار گیرند.

بررسی اثرهای دو ضدیخ مختلف بر زنده ماندن، حرکت، مورفولوژی و قدرت بارورسازی اسپرم موش پس از انجماد- ذوب اسپرم ها از بخش دم اپی دیدیم موش های نژاد NMRI با سن 10-8 هفته تهیه و به گروه های شاهد و آزمون 1 و 2 تقسیم شدند. ضدیخ گروه آزمون 1 شامل 18 (w/v) درصد رافینوز و 3 (w/v) درصد شیر خشک در آب مقطر، ضدیخ آزمون 7 (v/v) 2 درصد گلیسرول، 1 (w/v) درصد گلوکز و (v/v) 25 درصد زرده تخم مرغ در PBS بود، ضد یخ مورد نظر در هر گروه به اسپرم ها افزوده شد. پس از گذشت 2 دقیقه در هوای آزمایشگاه، ابتدا نمونه ها 10 دقیقه در گاز نیتروژن سرد شده و سپس مستقیما در نیتروژن مایع غوطه ور گردیدند. برای ذوب، نمونه ها از نیتروژن مایع خارج و در حرارت آزمایشگاه و آب 37° سانتیگراد قرار داده شدند. پس از شستشو در محیط T6-BSA، درصد زنده ماندن، حرکت و مورفولوژی اسپرم ها در گروه های آزمون اندازه گیری و با گروه شاهد مقایسه گردیدند.
تخمک موشهای ماده نژاد NMRI با سن 10-6 پس از تحریک تخمک گذاری با استفاده از تزریق داخل صفاقی گنادوتروپینها و گذشت 13-12 ساعت از لوله فالوپ خارج و با اسپرمهای گروه های مختلف تلقیح شدند و تشکیل پیش هسته ها و تکامل زیگوت تک سلولی به دو سلولی بررسی شد. برای هر دو گروه آزمون، تست سمیت نیز انجام شد.
نتایج این تحقیق نشان داد که در گروه های کنترل و آزمون 1 و 2، میزان زنده ماندن اسپرم در گروه های شاهد، آزمون به ترتیب 80.3، 35.8، 20.5 درصد، میزان حرکت آنها به ترتیب 75.4 و 31.8 و 18.6 درصد، میزان اسپرمهای نرمال به ترتیب 57.2 و 43.2 و 37.8 درصد و درصد باروری آنها به ترتیب 87 و 31 و 20 می باشد. تمام تفاوتها میان گروه شاهد و گروه های آزمون معنی دار بود.
برای انجماد اسپرم موش ضدیخ رافینوز بهتر از گلیسرول- گلوکز محسوب می شود اما مطالعات بیشتری برای بهبود این روش انجمادی مورد نیاز می باشد.

هدف از این مطالعه ارزیابی تکوین جنین های موش در مرحله مورولا، بلاستوسیست اولیه و ثانویه پس از انجماد شیشه ای در محیط های R2 و R2+Vero بود.
مورولاها، بلاستوسیست های اولیه و ثانویه از موش های ماده نژاد NMRI، پس از تحریک تخمک گذاری به دست آورده شدند. گروهی از آنها را به مدت 2 دقیقه در معرض 40 EFS درصد مخلوطی از اتیلن گلیکول) و فایکول 70 و سوکروز بود، قرار داده شده و پس از جای دادن در نی 0.25 میلی لیتر به مدت 3 تا 5 دقیقه در معرض بخار نیتروژن و سپس در نیتروژن مایع غوطه ور شدند. پس از ذوب، جنینها به مدت 5 دقیقه در معرض محلول 0.5 مول سوکروز قرار داده شدند. پس از آن دو گروه کنترل و انجمادی به مدت 5 روز (120 ساعت) در محیط های R2 یا R2+Vero کشت داده شدند.
نتایج حاصله، حاکی از زنده بودن درصد بالایی از مورولاها، بلاستوسیست اولیه و ثانویه انجمادی (به ترتیب 95، 85 و 76 درصد) بود. پس از 48 ساعت به ترتیب 63، 70 و 75 درصد در محیط از R2 و 67، 73 و 80 درصد در محیط R2+Vero از مورولاها، بلاستوسیستهای اولیه و ثانویه گروه کنترل به مرحله «در حال خروج از زونا» و «خارج شده از زونا» رسیدند، در حالی که در گروه انجمادی به ترتیب 24، 19 و 12 درصد در محیط R2 و 28، 22 و 16 درصد در محیط R2+Vero از مورولاها، بلاستوسیستهای اولیه و ثانویه به مرحله «در حال خروج از زونا» و «خارج شده از زونا» رسیدند. در روز چهارم کشت و پس از یک تاخیر 48 ساعته نسبت به گروه کنترل 65، 58 و 49 درصد در محیط R2 و 70، 63 و 56 درصد در محیط R2+Vero از مورولاها، بلاستوسیستهای اولیه و ثانویه انجمادی به مرحله «در حال خروج از زونا» و «خارج شده از زونا» رسیدند.
نتایج حاصله از تحقیق حاضر حاکی از این است که محیطهای کشت R2 و R2+Vero در کمک به تکوین جنینهای گروه انجمادی قابلیتهای تقریبا یکسانی دارند و از این رو می توان به جای استفاده از محیطهای هم کشتی از محیط کشت R2 که کم هزینه تر و راحت تر استفاده کرد. تاخیر 48 ساعته تکوین جنینهای انجمادی نسبت به گروه کنترل حاکی از آسیب جنین ها در طی انجماد و ذوب می باشد و آسیبهای وارده به جنین متعاقب انجماد شیشه ای برگشت پذیر است و نیاز به زمان دارد.

جریان های یونی دارای رفتار غیرخطی و تحریکات الکتریکی است که می تواند در کینتیک فعال یا غیرفعال شدن آنها تاثیر بگذارد. سرعت مراحل دپلاریزه کننده و هیپرپلاریزه کننده امواج تحریک کننده می تواند با تاثیر بر ویژگی های الکتروفیزیولوژیکی جریان های یونی نحوه فعالیت نورون ها را تغییر دهند. در این مطالعه اثر پتانسیل های فرمانی شبه ذوزنقه ای بر ویژگی های بیوفیزیکی کانال کلسیمی با آستانه بالا نوع L جسم سلولی نورون F1 در حلزون باغی مورد مطالعه قرار گرفت.
8 نورون F1 با استفاده از دو شکل پتانسیل فرمانی راست گوشه و شبه ذوزنقه ای از پتانسیل های نگهدارنده 90- و 40- میلی ولت تا 90+ میلی ولت در رینگر فاقد سدیم و پتانسیل دپلاریزه شدند. سپس نورون های F1 در حضور نیفدیپین، آنتاگونیست اختصاصی و انتخابی کانال کلسیمی با آستانه بالا نوع L، با استفاده از دو شکل پتانسیلهای فرمانی کلمپ شدند.
در رینگر فاقد سدیم و پتاسیم پتانسیلهای فرمانی شبه ذوزنقه ای در مقایسه با پتانسیل های فرمانی راست گوشه جریان کلسیمی را 36 درصد کاهش داده و ولتاژ آستانه را به طرف پتانسیل های مثبت تر سوق دادند. در حضور نیفدیپین با آنکه پتانسیل های فرمانی شبه ذوزنقه ای در مقایسه با پتانسیلهای فرمانی راست گوشه موجب مثبت تر شدن ولتاژ آستانه شدند ولی در میزان حداکثر جریان تغییری به وجود نیاوردند.
نتایج حاصل از این تحقیق نشان می دهد که هیپرپلاریزاسیون آهسته مرحله پایین رو کلمپ ولتاژ با تاثیر بر کینتیک کانال های یونی، موجب تغییر رفتار آنها می گردد. شاید بتوان با استفاده از این شکل امواج و یا اشکال دیگر به طور الکتروفیزیولوژیک و بدون استفاده از مهار کننده های شیمیایی موجب فعال و یا غیرفعال شدن انتخابی کانال های یونی شد.

مدلهای حیوانی بیماری پارکینسون با آسیب ناقص سیستم دوپامینرژیک نیگرواستریاتال برای ارزیابی روش های درمانی بسیار مناسب می باشند. در این رابطه اگر چه به طور متداول از رفتار چرخشی بدنبال تجویز داروهای دوپامینرژیک استفاده می شود، ولی به علت بروز پدیده حساسیت استفاده از یک تست صرفا رفتاری که حیوان را بدون تجویز دارو مورد ارزیابی قرار دهد معرف بهتری از پاسخ طبیعی حیوان خواهد بود. لذا تحقیق حاضر میزان کاربرد تست سوئینگ را در مدل اولیه (Early) بیماری مورد بررسی قرار می دهد.
30 عدد موش صحرایی نیز به طور تصادفی به دو گروه کنترل (Sham-operated) و ضایعه دیده (Lesion) تقسیم شدند. در این بررسی مدل اولیه بیماری پارکینسون توسط تزریق استریوتاکسیک 12.5 میکروگرم 6- هیدروکسی دوپامین به داخل استریاتوم طرف چپ ایجاد گردید. رفتار چرخشی بدنبال تزریق آپومورفین در طی یک ساعت و رفتار سوئینگ به مدت 45 ثانیه یک هفته قبل از جراحی و درهفته های دوم و چهارم پس از جراحی مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج بررسی های رفتاری نشان می دهد که در هفته های دوم و چهارم پس از جراحی، آپومورفین موجب بروز رفتار چرخشی به سمت مقابل ناحیه آسیب دیده در مقایسه با گروه کنترل می گردد که این تفاوت معنی دار است (P<0.0001). به علاوه، با انجام تست سوئینگ تفاوت معنی داری بین دو گروه کنترل و ضایعه دیده در هفته های دوم (P<0.01) و چهارم(P<0.056) مشاهده گردید. با انجام آنالیز همبستگی بین تعداد چرخش و سوئینگ در دو گروه کنترل و ضایعه دیده، رابطه معنی دار فقط در هفته دوم (r=0.52) به دست آمد.
نتایج نشان می دهد که کارآیی تست سوئینگ در ارزیابی میزان عدم تقارن حرکتی در مدل اولیه و یکطرفه بیماری پارکینسون، در حد متوسط و کمتر از کارآیی تست متداول چرخش القا شده بر اثر داروهای دوپامینرژیک است. بنابراین به منظور به حداقل رساندن پدیده حساسیت به داروهای دوپامینرژیک استفاده از تست سویینگ به صورت متناوب با تست رفتار چرخشی بدنبال تجویز آگونیستهای دو پامینرژیکی (آپومورفین و آمفتامین) در مدل اولیه بیماری پارکینسون، توصیه می گردد.

تهیه مقادیر بالایی از هپاتوسیتهای ایزوله برای استفاده در آزمایشات In vitro برای پرفیوژن کبد موش از یک مجموعه تجهیزات به نام سیستم پرفیوژن استفاده می شود که اجزای آن شامل یک پمپ پریستالتیک، حمام آب گرم، pH متر، کپسول گاز اکسیژن و دی اکسید کربن، فلومتر، تعدادی لوله های پلی اتیلنی و کانول است.
پرفیوژن کبد را می توان به دو روش تک مرحله ای و دو مرحله ای انجام داد. در روش دو مرحله ای ابتدا کبد با یک محلول بافری فاقد یون کلسیم و به همراه یک شلاته کننده کلسیم، پرفیوژ داده شده و در مرحله دوم پرفیوژن با محلول بافری حاوی آنزیم کلاژناز ادامه می یابد. بدین ترتیب با حذف اتصالات بین سلولی و بافت همبند، هپاتوسیتها پس از باز کردن کپسول کبدی به راحتی و بدون هیچ گونه آسیبی به آنها از هم جدا می شوند.
در این روش بازده هپاتوسیتهای ایزوله سالم بسیار بالا می باشد (بیش از 90 درصد) به طوری که در هر بار پرفیوژن کبد رت با وزن تقریبی 200 گرم حدود 500 میلیون سلول سالم به دست می آید. هپاتوسیتهای جدا شده در این روش فعالیت متابولیکی خود را حدود 10 ساعت حفظ می کنند.
به دلیل ویژگی های خاص این روش بهینه، از جمله بازده بالای هپاتوسیتهای ایزوله سالم و نیز حفظ فعالیت متابولیکی آنها در زمانهای نسبتا طولانی، دارا بودن اکثر ویژگی های یک سلول سالم در In vitro از جمله نفوذپذیری آنها، امکان طراحی سیستم در داخل کشور، سهولت کار و نیز صرفه جویی در مصرف دارو، انجام صدها آزمایش تنها به وسیله یک نمونه حیوان، رفع مشکل واکنش حیوان نسبت به برخی از داروها، صرفه جویی در زمان آزمایش های مربوطه به پاسخ حیوان به دوز دارو، می توان از آن به عنوان یک جانشین مناسب جهت آزمایشاتی که روی مدلهای حیوانی، رده های سلولی و نیز فراکسیونهای سلولی انجام می شود، استفاده نمود.