فهرست مطالب

پژوهش های آسیب شناسی زیستی - سال چهاردهم شماره 4 (پیاپی 32، زمستان 1390)
  • سال چهاردهم شماره 4 (پیاپی 32، زمستان 1390)
  • تاریخ انتشار: 1391/02/09
  • تعداد عناوین: 9
|
  • هانیه آقابابا، اشرف محبتی مبارز، مهرداد بهمنش، نیما خرم آبادی، مهدی نجاتی صفحه 2
    هدف
    کمپلکس آنتی ژن 85 مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شامل سه پروتئین ترشحی است که خاصیت ایمنی زایی دارند. این پروتئین ها کاندیداهای مهمی در طراحی واکسن سل هستند. برای استفاده از این پروتئین ها به عنوان واکسن های زیرواحدی یا به عنوان یادآور برای BCG نوترکیب یا واکسن های DNA، تولید آنتی ژن های پروتئینی به شکل نوترکیب الزامی است. پروتئین های مایکوباکتریوم که در دیواره هستند نسبتا غیرقطبی است و تولید آن ها به شکل نوترکیب در سویه بیانی اشریشیا کلی با پروتئین های دیگر متفاوت است. هدف از این مطالعه تولید و تخلیص آنتی ژن نوترکیب 85C به عنوان یک ایمنوژن است.
    مواد و روش ها
    آنتی ژن 85C در حامل پلاسمیدی pJET1.2 و در نهایت در pET32a(+) کلون و در هر دو پلاسمید تعیین توالی شد. القای تولید پروتئین با IPTG صورت گرفت و تخلیص با حل کردن اجسام توده ای داخل سلولی در اوره، جذب با رزین نیکل، حذف اوره با شیب کاهشی اوره در محلول های شستشو و در نهایت جمع آوری پروتئین نوترکیب به شکل محلول انجام شد. تایید آنتی ژنیک پروتئین نوترکیب با وسترن بلات و توسط آنتی بادی ضد پلی هیستیدین، آنتی سرم پلی کلونال خرگوشی ضد مایکوباکتریوم توبرکولوزیس و سرم بیمار سلی بستری انجام شد.
    نتایج
    ژن آنتی ژن 85C با موفقیت کلون و با تعیین توالی تایید شد. آنتی ژن 85C در میزبان اشریشیا کلی بیان و تخلیص شد.
    نتیجه گیری
    نتایج وسترن بلات به موازات نتایج تعیین توالی نشان دهنده درستی تولید پروتئین آنتی ژن 85C نوترکیب و حفظ نسبی ساختار اپی توپی آن است.
    کلیدواژگان: کمپلکس آنتی ژن 85، آنتی ژن 85C واکسن سل، مایکوباکتریوم توبرکلوزیس
  • کاظم باعثی، مهرداد روانشاد، مریم قنبری صفری، اسماعیل صابرفر، محبوبه حاجی عبدالباقی صفحه 14
    هدف
    استفاده از داروهای ضد رترو ویروسی تاثیر زیادی در کنترل پیشرفت بیماری ایدز داشته است، اما در سال های اخیر به دلیل به وجود آمدن سویه های مقاوم به دارو، نگرانی زیادی در درمان موثر بیماری به وجود آمده است. هدف از این مطالعه تعیین جهش های مقاومت دارویی ژن پروتئاز در بین بیماران تحت درمان و هم بیمارانی که دارو دریافت نمی کنند، است.
    مواد و روش ها
    در گروه اول پلاسمای 30 بیمار مبتلا به ویروس نقص ایمنی انسان که تحت درمان ضد رتروویرسی نیستند و در گروه دوم پلاسمای 16 بیمار مبتلا به ایدز که ترکیب دارویی زیدوودین، لامیوودین و کلاترا دریافت می کنند، مورد آزمایش قرار گرفت. پس از استخراج ژنوم، Nested RT-PCR انجام شد و نمونه ها پس از تایید توسط الکتروفورز توالی یابی شد و سپس برای تشخیص جهش و تعیین تحت تیپ ها مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
    نتایج
    نتایج نشان داد که در نمونه های گروه اول که دارو مصرف نمی کنند، هیچ گونه جهشی رخ نداده است اما در گروه دوم که تحت درمان هستند40 درصد مقاومت به مهار کننده های پروتئاز وجود دارد. همچنین تعیین تحت تیپ ها نیز نشان می دهد که 50 درصد نمونه ها تحت تیپ A، 6/40 درصد تحت تیپ B، 2/6 درصد تحت تیپ D و 2/3 درصد تحت تیپ C است.
    نتیجه گیری
    انتقال سویه های مقاوم در بین جامعه از نظر اپیدمیولوژیکی مهم است و تشخیص سریع این سویه های مقاوم از اهمیت بسیار بالایی برخوردار است. با توجه به مطالعات دیگران و نتایج مطالعه حاضر بهتر است که به جای کلاترا، یکی دیگر از مهار کننده های پروتئازی را جایگزین این دارو نمایند.
    کلیدواژگان: ایدز، جهش، مقاومت دارویی، پروتئاز
  • محمود بزرگمهر، امیرحسن زرنانی، علی شیخیان، مژده صالح نیا، علی جباری ارفعی، سید محمد موذنی صفحه 24
    هدف
    سلول های بنیادی خون قاعدگی از نظر عملکردی و فنوتیپی به سلول های بنیادی مزانشیمی شبیه هستند. سلول های بنیادی مزانشیمی فعالیت و تولید سلول های دندریتیک را مهار می کنند؛ اما درباره تاثیر سلول های بنیادی خون قاعدگی بر سلول های سیستم ایمنی اطلاعات کمی وجود دارد. در مطالعه حاضر، تاثیر این سلول ها بر تمایز سلول های دندریتیک از مونوسیت بررسی شد.
    مواد و روش ها
    خون قاعدگی از خانم های سالم در دوره قاعدگی تهیه شد. سلول های تک هسته ای چسبان جدا شده و پس از دو هفته کشت، سلول های بنیادی خون قاعدگی به دست آمدند. سلول های مونوسیت در حضور سایتوکین های اینترلوکین 4 و فاکتور محرک کلونی گرانولوسیت- مونوسیت به سمت سلول های دندریتیک در حضور و عدم حضور سلول های بنیادی خون قاعدگی، تمایز داده شدند. پس از 5 روز میزان تولید نشانگرهای سلول های دندریتیک و مونوسیت اندازه گیری شد. میزان تولید سایتوکین اینترلوکین 6 نیز در مایع رویی کشت ها اندازه گیری شد.
    نتایج
    در حضور سلول های بنیادی خون قاعدگی، درصد سلول های دارای نشانگرهای سلول های دندریتیک (CD1a) و مونوسیت (CD14) به ترتیب کاهش و افزایش معنی داری را نشان داد. میزان تولید اینترلوکین 6 در مایع رویی هم کشتی سلول های بنیادی خون قاعدگی با مونوسیت افزایش معنی داری داشت.
    نتیجه گیری
    مطالعه حاضر نشان داد سلول های بنیادی خون قاعدگی تمایز سلول های مونوسیت به دندریتیک را مهار می کنند. این اثر می تواند به افزایش تولید سایتوکین اینترلوکین 6 نسبت داده شود. با توجه به محاسنی که برای سلول های بنیادی خون قاعدگی ذکر شده، این سلول ها می توانند جایگزین مناسبی برای سلول های بنیادی مزانشیمی در کارهای بالینی آینده باشند.
    کلیدواژگان: سلول بنیادی خون قاعدگی، سلول دندریتیک، مونوسیت، بلوغ، نشانگر سطحی
  • سمانه حسین زاده، فاطمه فتوحی، بهرخ فرهمند، مریم صالح، آتنا یوسفی، بهناز حیدرچی، معصومه توسطی خیری صفحه 38
    هدف
    ویروس آنفلوانزای A (H1N1) از مهم ترین زیرگونه های ویروس آنفولانزاست که منجر به پیامدهای متعددی در جهان شده است. هماگلوتینین یکی از مهم ترین آنتی ژن های این ویروس می باشد که باعث ایجاد پاسخ ایمنی می شود. اتصال این پروتئین به گیرنده های سلول میزبان منجر به شروع فرایند بیماری زایی می شود.
    با توجه به نقش حیاتی مرحله اتصال ویروسی، این پژوهش درصدد استخراج و جای سازی ژن هماگلوتینین و زیرواحد بزرگ آن (HA1) با هدف تولید شاتل ناقل نوترکیب باکیولوویروس (بکمید) برای تولید پروتئین نوترکیب در سلول های حشره است.
    مواد و روش ها
    RNA ویروس آنفلوانزای انسانی A/New Caledonia 99/20/(H1N1) در کشت سلولی MDCK تکثیر شده و RNA کامل ویروسی توسط محلول Easy–red تخلیص شد. سپس طول کامل ژن هماگلوتینین و ژن HA1 توسط روش RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی تکثیر و ابتدا در ناقل pGEM-TEasy و سپس در پلاسمید pFastBac HT جای سازی شد. در نهایت بکمید نوترکیب واجد ژن های فوق در سلول های میزبان DH10Bac تولید شد.
    نتایج
    محصولات PCR ژن هماگلوتینین با الکتروفورز روی ژل آگارز و هضم با آنزیم های محدودالاثر ارزیابی شد. ناقل نوترکیب pGEM-Teasy و پلاسمید دهنده نوترکیب pFastBac HT توسط روش PCR، هضم آنزیمی و تعیین ترادف تایید شد. تولید DNA نوترکیب بکمیدی نیز توسط افتراق کلونی های آبی-سفید، الکتروفورز روی ژل آگارز 7/0 درصد، PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و آغازگرهای pUC/M13 مورد تایید قرار گرفت.
    نتیجه گیری
    در این پژوهش، بکمید نوترکیب واجد ژن هماگلوتینین و زیرواحد بزرگ آن با موفقیت ساخته شد. در ادامه سلول های حشرات به منظور تولید باکیولوویروس نوترکیب با سازه های فوق ترانسفکت شده و پروتئین های نوترکیب برای مطالعات آتی تولید خواهد شد.
    کلیدواژگان: DNA نوترکیب، باکیولوویروس، هماگلوتینین، واکسن زیرواحدی
  • احسان عارفیان، طراوت بامداد، مسعود سلیمانی، امیر آتشی، پرویز فلاح صفحه 50
    هدف
    ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک پس از آلوده کردن میزبان به صورت طبیعی در گانگلیون نورون تریژمینال به صورت خفته در می آید. در این وضعیت تنها رونوشتی که از ویروس در سلول قابل تشخیص است رونوشت وابسته به نهفتگی (LAT) است که این رونوشت microRNAهایی را تولید می کند که قادر است مسیرهای پیام رسانی در سلول را دستخوش تغییر نماید. یکی از مسیرهای کلیدی پیام رسانی سلول مسیر فاکتور رشد تومور (TGF-β) است. در این مسیر ژن Smad4 به عنوان یک پروتئین مهم رابط بین گیرنده های غشایی کینازهای سیتوپلاسمی و فاکتورهای رونویسی هسته ای است. این تحقیق با بررسی بیان microRNAهای ویروسی در سلول میزبان هدف گیری ژن Smad4 با این microRNAها را بررسی نموده است.
    مواد و روش ها
    پس از ترانسفکت ژن LAT به داخل سلول های BE-2(c)، بیان microRNAهای وابسته به LAT در این سلول ها به کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی (Real-Time PCR) ارزیابی شد و به کمک روش های مبتنی بر بیوانفورماتیک امکان هدف گیری ژن Smad4 با این microRNAها نیز بررسی و در ادامه بیان ژن Smad4 و ژن های پایین دست آن به کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی مطالعه شد.
    نتایج
    شواهد و نتایج نشان می دهد که رونوشت LAT در سلول میزبان تولید microRNAهایی می کند که تجزیه و تحلیل های بیوانفورماتیکی دو الگوریتم متفاوت گواهی بر هدف گیری ژن Smad4 توسط این microRNAها می دهد این در حالی است که نتایج واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی نیز تاییدی بر این ادعاست.
    نتیجه گیری
    نتایج مبتنی بر تجزیه و تحلیل های بیوانفورماتیک و بررسی بیان رونوشت Smad4 و پروتئین های پایین دستش همانند CyclinD، CDK2 و Myc نشان دهنده کنترل بیان این ژن توسط microRNAهای ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک است.
    کلیدواژگان: ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک، رونوشت وابسته به نهفتگی، microRNA، پروتئینSmad4
  • فاطمه متولی، آرش معمار نژادیان، سید مهدی سادات، گلناز بهرامعلی، فرزین روحوند صفحه 62
    هدف
    مطالعات حیوانی نشان می دهند که واکسیناسیون با پپتیدهای اپی توپی منجر به ایمنی حفاظتی می شود. با این وجود غلبه ایمنولوژیکی باید به عنوان یک چالش مهم در این زمینه مورد توجه قرارگیرد. با توجه به مزایای واکسن های اپی توپی علیه عفونت هپاتیت C، در این مطالعه بروز پدیده غلبه ایمنولوژیکی به دنبال ایمن سازی موش ها با سه ترکیب مختلف پپتیدهای اپی توپی ویروس هپاتیت C مقایسه شده است.
    مواد و روش ها
    چهار پپتید اپی توپی وابسته به سلول های CD8+ (C1، E6، N و E4) برگرفته از آنتی ژن های ویروس هپاتیت C ساخته شد. پپتید چند اپی توپی (C1E6NE4) حاصل از اتصال چهار اپی توپ نیز بر اساس مطالعات ایمونوانفورماتیک با هدف بهینه سازی برش پروتئازوم طراحی شد. موش های BALB/c سه تزریق زیرجلدی شامل 10 میکروگرم پپتید (به صورت پپتید اپی توپی یا مخلوط اپی توپ ها یا پپتید پلی توپ) ترکیب شده با اجوانت های CpG (50 میکروگرم) و MontanideISA720 (70 درصد) را در قاعده دم با فاصله سه هفته دریافت کردند. با توجه به وابستگی دو اپی توپ C1 و E4 به H2-Dd موشی، سه هفته پس از آخرین تزریق از سلول های طحال موش های واکسینه در حضور پپتیدهای C1 و E4 برای آزمون های IFNg/IL4 ELISpot استفاده شد.
    نتایج
    در کلیه حیوانات واکسینه پاسخ Th1 که با مشخصه ترشح بالای اینترفرون گاما و ترشح کم اینترلوکین 4 شناخته می شود ایجاد شده بود. موش های ایمن شده با اپی توپ های تکی پاسخ قوی تری را نشان دادند، اما به علت گرایش بالاتر اپی توپ E4 برای H2-Dd پاسخ علیه آن قوی تر از پاسخ علیه اپی توپ C1 بود که نمایانگر بروز درجاتی از غلبه ایمنولوژیکی است. نکته جالب توجه این که حیوانات واکسینه با پپتید پلی توپ اگر چه با شدت ضعیف تر اما پاسخ یکسانی را علیه هر دو اپی توپ C1 و E4 نشان دادند.
    نتیجه گیری
    نتایج این مطالعه برتری پپتید پلی توپ را بر اپی توپ های تکی نشان داد و بر نقش کلیدی طراحی بهینه واکسن های پلی توپ برای جلوگیری از وقوع غلبه اپی توپی تاکید نمود.
    کلیدواژگان: ویروس هپاتیت C، اپی توپ، واکسن پپتیدی، غلبه ایمنولوژیکی، پلی توپ
  • فروزان یوسفی، معصومه ابتکار، مسعود سلیمانی، سیدمحمود هاشمی صفحه 74
    هدف
    بررسی اثر تزریق سلول های بنیادی مزاشیمی جدا شده از بافت چربی و محیط رویی کشت این سلول ها بر ارتشاح لکوسیتی مغز موش های مبتلا به آنسفالومیلیت خود ایمن تجربی
    مواد و روش ها
    در 20 سر موش ماده C57BL/6 مدل آنسفالومیلیت خودایمن تجربی القا و سپس موش ها به چهار گروه پنج تایی تقسیم شدند و پس از 15 روز، زمانی که تقریبا شدت بالینی علایم به یک رسید، به دو گروه از موش ها 106 عدد سلول بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت چربی موش C57BL/6به صورت درون رگی و 106×2 عدد سلول بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت چربی به درون صفاق و به یک گروه از آن ها 6 نوبت محیط رویی کشت سلول های بنیادی مزانشیمی و هر نوبت یک سی سی به صورت درون صفاقی تزریق شد. یک گروه از موش ها نیز بدون هیچ تیماری به عنوان گروه کنترل باقی ماند. پس از 60 روز اثر سلول ها و محیط رویی کشت این سلول ها بر ارتشاح لوکوسیتی مغز در چهار گروه با هم مقایسه شد.
    نتایج
    ارتشاح لوکوسیتی در گروه هایی که سلول بنیادی مزانشیمی و محیط رویی کشت سلول های مزانشیمی را دریافت کرده بودند در مقایسه با گروه کنترل آنسفالومیلیت خود ایمن تجربی که هیچ تیماری دریافت نکرده بود، کاهش معنی داری نشان داد (P<0.05). وزن و میزان بقای موش های تیمار شده در مقایسه با گروه کنترل افزایش داشت.
    نتیجه گیری
    سلول های بنیادی مزانشیمی جدا شده از چربی خواص تنظیمی ایمنی و ترمیم بافت عصبی دارند که می تواند سبب بهبود موش های مبتلا به آنسفالومیلیت خودایمن تجربی در مقایسه با گروه کنترل شود.
    کلیدواژگان: سلول بنیادی مزانشیمی، آنسفالومیلیت خودایمن تجربی، محیط رویی کشت
  • مقاله کوتاه
  • زهرا دیلمی خیابانی، عنایت نوری، مهدی رهنما، رضا شاپوری، یدالله بیگدلو، دنا قمری، حوا آصفی صفحه 88
    هدف
    باسیلوس سرئوس باکتری گرم مثبت و اسپورزایی است که به طور وسیعی در طبیعت انتشار دارد. بسیاری از سویه های این باکتری باعث مسمومیت غذایی با علایم اسهال و استفراغ می شوند. بیماری های نوع اسهالی توسط انتروتوکسین های همولیزین HBL، غیرهمولیتیک NHE و سیتوتوکسین K ایجاد می شود. برنج یکی از غذاهای پرمصرف در ایران است که ممکن است توسط باسیلوس سرئوس آلوده شود. هدف از این تحقیق بررسی حضور ژن های انتروتوکسیژنیک کمپلکس NHE باسیلوس سرئوس های جدا شده در تعدادی برنج های خردیداری شده استان زنجان بود.
    مواد و روش ها
    تعداد ده نمونه برنج به طور تصادفی از فروشگاه ها خریداری شد. از هر نمونه برنج و با استفاده از محیط کشت انتخابی (PEMPA)، باسیلوس سرئوس جداسازی شد. روی این کلونی های جدا شده آزمون های تاییدی بیوشیمیایی انجام گرفت، همچنین تشخیص مولکولی باسیلوس سرئوس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام شد. سپس نمونه های تایید شده از نظر باسیلوس سرئوس برای ژن های کمپلکس NHE با آغازگر های اختصاصی و با روش PCR چندگانه بررسی شدند.
    نتایج
    مطابق یافته ها تمام نمونه های برنج مورد مطالعه با باکتری های باسیلوس سرئوس آلوده بودند و در هشت نمونه از باکتری های جدا شده ژن های کمپلکس NHE مشاهده شد.
    نتیجه گیری
    با توجه به این که باسیلوس سرئوس می تواند دماهای بالا را تحمل کند، در برنج پخته شده اسپور ها می توانند در اثر حرارت مجدد جوانه بزنند. PCR چندگانه برای کمپلکس NHE روش سریع و مطمئنی برای شناسایی باسیلوس سرئوس انتروتوکسیژنیک از غیر انتروتوکسیژنیک است. با وجود آن که که برنج رژیم اصلی ایران است، مطالعه کمی از نظر میکروبیولوژی روی این ماده غذایی صورت گرفته است. افزایش اطلاعات درباره بیماری زایی و شیوع ژن های مهم در مسمومیت غذایی می تواند در پیشگیری از مسمومیت های غذایی موثر باشد.
    کلیدواژگان: باسیلوس سرئوس، برنج، ژن های کمپلکس NHE، PCR چندگانه
  • زهرا شهاب موحد، سیروس زینلی، محمد مهدی اصلانی صفحه 96
    هدف
    برای نگهداری DNA میکروارگانیسم ها از روش های سنتی در دمای پایین 4، 20- و 80- درجه سانتی گراد استفاده می شود. کارت نگهداری DNA یک روش نوین نگهداری DNA در دمای اتاق است. به منظور بررسی پایداری DNA باکتری و تعیین بهترین روش نگهداری DNA روی کارت نگهداری DNA طراحی شد.
    مواد و روش ها
    از یک جفت آغازگر از قسمت حفاظت شده دومین 16 srRNA برای شناسایی اشریشیا کلی استفاده و چهار نوع مختلف نمونه باکتریایی شامل سوسپانسیون باکتری، DNA خالص باکتری به روش فنل- کلروفرم، باکتری لیز شده با بافر لیز کننده و DNA باکتری با روش جوشاندن تهیه و در روی کارت جداگانه ریخته و در دمای اتاق خشک شد. سپس در زمان های 3، 5 و 7 ماه پایداری DNA باکتری اشریشیا کلی با دو روش مولکولی PCR مرسوم با تعداد 1، 2، 3 دیسک (به قطر 1 میلی متر) به عنوان منبعی از DNA باکتری و Real-Time PCR بررسی شد.
    نتایج
    DNA باکتری پس از هفت ماه روی یک دیسک از کارت نگهداری DNA پایداری خود را حفظ نمود و حتی یک پانچ از دیسک به عنوان منبع DNA کافی بود. اما سوسپانسیون باکتری بهترین روش نگهداری طولانی مدت DNA باکتری روی کارت نگهداری DNA است.
    نتیجه گیری
    در روش های سنتی نگهداری DNA، پس از منجمد و ذوب شدن DNA کیفیت آن کاهش می یابد اما در روش کارت نگهداری DNA کیفیت DNA برای زمان طولانی تر حفظ می شود و علاوه برآن این روش مزایایی مانند آسانی در کارکردن با نمونه، قیمت پایین، تخلیص سریع تر و در نهایت کاهش آلودگی فردی و محیطی را دارد.
    کلیدواژگان: کارت نگهداری DNA، سوسپانسیون باکتری، روش های نگهداری DNA باکتری، Real، time PCR
|
  • Hanieh Aghababa, Ashraf Mohabbati Mobarez*, Mehrdad Behmanesh, Nima Khoram Abadi, Mehdi Nejati Page 2
    Objective
    Antigen 85 complex of Mycobacterium tuberculosis includes three immunogenic proteins which are important TB vaccine candidates. The use of these protein as a component of subunit vaccines, as a part of DNA vaccines or recombinant BCG boosters, enhances their recombinant production. Recombinant production of these mycobacterial proteins located in the cell wall somehow differs from the other proteins, as they are partially apolar. Therefore, this study aims to produce recombinant Ag85C as a vaccine candidate.
    Methods
    Ag85C gene was cloned in pJET1.2 and subsequently in pET32a(+). Both recombinant plasmids were sequenced. Expression of the recombinant protein was induced with 1mM IPTG. Recombinant Ag85C was purified through dissolving the inclusions in 8M urea buffer, absorbed to Ni-NTA resins, washed by buffers with decreasing urea concentrations, and finally eluted in aqueous solution. Western blot analysis was performed using anti-6His tag antibody, rabbit anti-M. tuberculosis polyclonal antibody, and the serum from hospitalized TB patients.
    Results
    Ag85C successfully cloned in both plasmid vectors. The recombinant Ag85C expressed in the E. coli host and was purified with significant yield.
    Conclusion
    Western blot results along with that of sequencing ensure accurate production of recombinant Ag85C, retaining its partial epitopes.
    Keywords: Ag85 Complex, Ag85C, Tuberclosis Vaccine, Mycobacterium tuberculosis
  • Kazem Baesi, Mehrdad Ravanshad, Maryam Ghanbari Safari, Esmaeil Saberfar, Mahboubeh Hajiabdolbaghi Page 14
    Objective
    The use of antiretroviral drugs has proven remarkably effective in controlling the progression of human immunodeficiency virus (HIV) disease, but these benefits can be compromised by the development of drug resistance. This study aims to assess the drug resistance profile of the Pr gene in highly active antiretroviral therapy (HAART)-treated and naïve HIV-1 infected patients.
    Methods
    A total of 30 samples from naïve and 16 samples of highly active antiretroviral therapy (HAART)-treated patients were collected and divided into two groups. After RNA extraction, RT nested PCR was performed. The final products were sequenced and then analyzed for drug-resistant mutations and subtypes.
    Results
    No drug resistant mutations were noted in group one that have never used drug, but 40% of group two samples which are under treatment contained drug resistant mutations. According to the results, the following subtypes were seen among patients: A (50%), B (40.6%), D (6.2%), and C (3.2%).
    Conclusion
    Transmission of drug-resistant viruses and their detection are very important epidemiologically. However our data and other studies suggest that other PIs should be replaced by LPV in the HAART regime.
    Keywords: AIDS, Mutation, Drug Resistance, Protease
  • Mahmood Bozorgmehr, Amir Hassan Zarnani, Ali Sheykhian, Mojdeh Salehnia, Ali Jabbari Arfaee, Seyed Mohammad Moazzeni Page 24
    Objective
    Menstrual blood stromal stem cells (MBSCs) share some phenotypic and functional similarities with mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs are shown to inhibit either the function or generation of different immune cells, including dendritic cells (DCs). However, data regarding MBSCs’ potential effects on immune system cells are elusive. Here, we examine whether MBSCs affect the generation of human monocyte-derived DCs.
    Methods
    Menstrual blood samples were collected from apparently healthy women on the second day of their menstrual cycles. The adherent portions were subcultured to omit unwanted cells and obtain MBSCs. Magnetically-isolated peripheral blood monocytes were differentiated towards DCs through treatment with recombinant granulocyte monocyte colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4) in the presence or absence of MBSCs. After five days, monocyte-derived DCs were analyzed for the expression of surface markers by flow cytometry. IL-6 level was determined in the co-culture supernatants.
    Results
    Co-culture with MBSCs significantly down regulated the expression of DC marker (CD1a) and up regulated the expression of monocyte marker (CD14) on monocyte-derived DCs compared with the control group. IL-6 level was shown to be significantly higher in the supernatant of the monocyte-MBSC co-culture.
    Conclusion
    Collectively, this is the first study to show the inhibitory impacts of MBSCs on the generation of DCs. IL-6 could be viewd as a potential factor mediating this effect. Regarding the known advantages over MSCs, MBSCs could be considered as a promising future candidate for immunomodulatory purposes in the clinical setting.
    Keywords: Menstrual Blood Stem Cell, Dendritic Cell, Monocyte, Maturation, Surface Marker
  • Samaneh Hossainzadeh, Fatemeh Fotouhi, Behrokh Farahmand, Maryam Saleh, Atena Yousefi, Behnaz Heydarchi, Masoumeh Tavassoti Kheiri Page 38
    Objective
    Influenza virus A (H1N1) is an important subtype of the influenza respiratory viruses, which has important worldwide implications. Hemagglutinin (HA), an important viral antigen, is responsible for binding to human cell receptors leading to an onset of the disease process. Considering the critical role of viral attachment, this study focuses on the extraction and cloning of HA and its large subunit HA1 genes to generate recombinant baculovirus shuttle vectors (bacmid) in order to produce recombinant proteins in insect cells.
    Methods
    Human influenza virus A/New Caledonia 99/20/(H1N1) was propagated in MDCK cell culture. Total viral RNA was extracted using easy-red solution. The full-length HA genome and HA1 fragment were amplified by RT- PCR using specific primers, cloned into a pGEM®-TEasy vector, and then subcloned into a pFastBac HT plasmid. Finally, recombinant bacmids that contained the genes of interest were produced in E. coli DH10Bac™ cells.
    Results
    Expected PCR products of HA genes were evaluated through gel electrophoresis and restriction enzyme analysis. Recombinant pGEM®-TEasy vectors and pFastBac HT donor plasmids were confirmed by PCR, digestion, and sequencing. Construction of recombinant bacmid DNA was verified by using blue-white colony screening, overnight electrophoresis, and PCR analysis that used either pUC/M13 or gene-specific primers.
    Conclusion
    In this study, we have successfully constructed recombinant Bacmid DNA that encoded the full-length HA genome and its HA1 subunit. We intend to transfect sf9 insect cells with these constructs to generate recombinant baculovirus and produce large amounts of desired proteins for future studies.
    Keywords: Recombinant DNA, Baculovirus, Hemagglutinin, Subunit Vaccine
  • Ehsan Arefian, Taravat Bamdad, Masoud Soleimani, Amir Atashi, Parviz Fallah Page 50
    Objective
    Infection with herpes simplex virus type 1 induces viral latency in neuron trigeminal ganglions. The late associated transcript (LAT) is uniquely expressed in infected neural cells, however no coding protein associated with these transcripts has been identified in infected cells. It has been shown that six microRNAs transcribed from LAT have the capabilities to affect the cell signaling pathways, thus interfering in pathways such as those of cell differentiation and proliferation. Transforming growth factor beta (TGF-β) pathway is a critical pathway among cell signaling circuits. The Smad4 protein, as an important member of the TGF-β signaling pathway, mediates the connection between membrane receptors, cytoplasmic kinases, and nuclear transcription factors.
    Methods
    This study bioinformatically and experimentally evaluated LAT microRNA expression and assessed microRNA targeting of Smad4 transcripts in human neuroblastoma cells by using real-time PCR.
    Results
    Analysis of two different softwares results showed that the Smad4 gene was targeted by LAT-derived microRNAs at multiple sites. Over-expression of LAT microRNAs in BE2(c) cells caused reduction in Smad4 transcripts.
    Conclusion
    The results of bioinformatical analysis with relative quantification of Smad4 transcripts and its downstream-related genes such as cyclinD, CDK2, and Myc showed that the LAT transcript could control Smad4 expression.
    Keywords: Herpes Simplex Virus, 1, Latency Associated Transcript, MicroRNAs, Smad4 Protein
  • Fatemeh Motevalli, Arash Memarnejadian, Seyed Mehdi Sadat, Golnaz Bahramali, Farzin Roohvand Page 62
    Objective
    Animal studies show that vaccination with epitope-based peptides results in protective immunity. However, immunodominance should be regarded as a major challenge in this area. Considering the advantages of epitopic-vaccines against hepatitis C virus (HCV) infection, herein, we compared the occurrence of immunodominance following mice immunization with three different HCV epitopic-peptide formulations.
    Methods
    We synthesized four CD8+ epitopic-peptides (C1,E6,N,E4) that were derived from HCV-antigens. A polytope-peptide (C1E6NE4) spanning fusion of epitopes was designed based on immunoinformatics analyses for optimum proteasomal cleavage. BALB/c mice received three subcutaneous injections that contained 10 µg of peptide (minimal epitopes, or mixture of four epitopes or long-polytope) formulated with CpG (50 µg) and Montanide-ISA720 (70%) adjuvants in the tail-base at three-week intervals. Considering the H2-Dd (BALB/c)-restriction of C1 and E4-epitopes, three weeks after the last injection splenocytes from vaccinated animals were subjected to IFNγ/IL4 ELISpot assays in the presence of C1 and E4-peptides.
    Results
    All vaccinated animals promoted Th1-oriented responses as evidenced by detection of IFNγ-secreting cells and a low-level of IL4 secretion. Mice injected with minimal CTL-epitopes provoked stronger responses, however, due to the higher affinity of E4-epitope for H2-Dd, frequency of E4-specific cells was considerably higher than C1-specific ones, showing some level of immunodominance. Interestingly, animals vaccinated with polytope-peptide developed high-quality balanced responses against both C1and E4-epitopes, however at a lower intensity.
    Conclusion
    These results supported the superiority of polytope-peptides over minimal epitopes, yet emphasized the key role of polytope design and optimization to avoid epitope dominancy.
    Keywords: HCV, Epitope, Peptide Vaccine, Immunodominance, Polytope
  • Forouzan Yousefi, Masoumeh Ebtekar, Masoud Soleimani, Seyed Mahmoud Hashemi Page 74
    Objective
    This study investigated the effects of adipose-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and conditioned medium injection on cell infiltration in the brains of an experimental C57BL/6 mice model of autoimmune encephalomyelitis (EAE).
    Methods
    EAE was induced with myelin oligodendrocyte glycoprotein (35-55 peptides) in 20 mice. MSCs were obtained from the adipose tissue of C57BL/6 mice and cultured with Eagle’s minimum essential medium/alpha medium (DMEM) after removal of non-adherent cells. After 2 to 3 passages, 15 days after induction of EAE, 4 groups (n=5) of C57BL/6 mice were treated as follows: i) MSCs were injected intraperitoneally, ii) MSCs were injected intravenously, iii) conditioned medium was administrated intraperitoneally, and iv) the control group received no treatment. After day 60, the mice brains were removed and the effect of adipose-tissue MSCs and administration of conditioned medium was investigated.
    Results
    Leukocyte infiltration and clinical scores were significantly reduced in animals that received MSC and conditioned medium compared to untreated animals. Body weight increased significantly in the treated groups compared to the control group. Percentage of survival also increased in the animals that received MSCs and conditioned medium as compared to the control group.
    Conclusion
    MSCs had immunomodulatory and neurogenerative functions which reduced leukocyte infiltration and improved clinical scores in the EAE animals that received MSC and conditioned medium compared to untreated animals with EAE.
    Keywords: Adipose, Tissue Mesenchymal Stem Cells, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), Conditioned Medium
  • Zahra Deilami Khiabani, Enayat Noori, Mehdi Rahnama, Reza Shapouri, Yadollah Bigdelo, Dena Ghamari, Havva Asefi Page 88
    Objective
    Bacillus cereus (B. cereus) is a gram-positive, spore-forming bacteria widely distributed in the environment. This bacteria is an opportunistic human pathogen that can cause diarrheal and emetic types of food poisoning. The diarrhea type of food poisoning can be caused by hemolysin BL (HBL), non-hemolytic (NHE), and cytotoxin K enterotoxins. Rice is commonly contaminated with B. cereus. The objective of this study is to detect enterotoxigenic genes of the NHE complex and assess their incidence in B. cereus isolates in rice samples from Zanjan, Iran.
    Methods
    We randomly purchased 10 different rice samples from food stores and cultured them in PEMPA. Following biochemical testing, the bacterial colonies were identified by PCR. B. cereus isolates were checked for the NHE complex genes by specific primers using multiplex PCR.
    Results
    Results showed that rice samples were contaminated with B. cereus. The NHE complex genes were found in 8 bacterial samples.
    Conclusion
    B. cereus is able to tolerate high temperatures; in cooked rice the spores can undergo germination by reheating. The results of this study have shown that NHE multiplex PCR is a prompt, reliable method for the differentiation between non-enterotoxigenic and enterotoxigenic isolates of B. cereus. Despite its common dietary role, rice in Iran has rarely been investigated from a microbiological point of view. Enhancing awareness about virulence and prevalence of genes involved in food poisoning would be effective in the prevention of food poisoning.
    Keywords: Bacillus cereus, Rice, NHE Complex, Multiplex PCR
  • Zahra Shahab Movahed, Sirous Zeinali, Mohammad Mehdi Aslani Page 96
    Objective
    Traditional methods for storing microbial DNA samples use the low-temperatures of 4 °C, -20°C or -80 °C. The DBC Card is a new method of storing microbial DNA at room temperature. This study evaluates the stability and determine the best storing method of Bacterial DNA on the DBC card.
    Methods
    In this study, we used a pair of primers from the conserved domain of 16srRNA designed to identify Escherichia coli. Four different types of samples we prepared: i) bacterial suspension, ii) bacterial DNA extracted by the phenol -chloroform method, iii) bacterial lysate with lysis buffer and iv) bacterial DNA produced by the boiling method. All four samples were spotted on separate DBC cards and dried at room temperature. After periods of 3, 5 and 7 months, Escherichia coli samples were checked for DNA stability with two molecular techniques, conventional PCR with 1, 2 and 3 disks as a source of bacterial DNA (1 mm diameter) and Real-Time PCR.
    Results
    Data showed that DNA stability was maintained after 7 months on a DBC disk, even using only one disk as a DNA source. The bacterial suspension was the best method for long-term storage of Escherichia coli DNA on the DBC Card.
    Conclusion
    In traditional methods for storing sample, DNA quality reduces after freezing and thawing. However in the DBC method, DNA quality was maintained for a long duration. Advantages of the DBC method are easy sample handing, low cost, faster extraction, and reduced individual and environmental contamination.
    Keywords: DNA Banking Card (DBC), Bacteria Suspension, Storing Method of Bacterial DNA, Real, Time PCR