فصلنامه بیماریهای گیاهی
سال پنجاهم شماره 2 (تابستان 1393)

گونه Phytophthora capsici اولین بار توسط لئونیان در سال 1922 از فلفل در نیومکزیکو جداسازی و توصیف شد. در ایران اگر چه P. capsici از میزبان های مختلف گزارش شده است، اما اطلاعات دقیقی در خصوص تنوع جمعیت، دامنه میزبانی، ساختار بقا و تیپ آمیزشی این قارچ در دست نیست. این پژوهش به منظور تعیین دامنه میزبانی بیمارگر به ویژه روی گیاهان چوبی انجام شد. دمای بهینه رشد، فراوانی تیپ آمیزشی و تشکیل کلامیدوسپور در محیط زنده و غیر زنده با استفاده از 20 جدایه P. capsiciاز میزبان های گیاهی مختلف شامل کدو، فلفل، گوجه فرنگی و علف هرز بررسی شد. نتایج نشان داد که هر دو تیپ آمیزشی بیمارگر با فراوانی تقریبا مساوی میان جدایه ها وجود داشت. بیمارگر کلامیدوسپورهای فراوانی روی محیط کشت هویج آگار، شاهدانه آگار و بافت ریشه و طوقه کدو تولید کرد. از بین شش گیاه چوبی مایه زنی شده، بادام، زردآلو و پسته رقم سرخس بالاترین میزان حساسیت را نشان دادند اما نهال های فندق، کیوی و ازگیل آلوده نشدند. تمام جدایه هایآزمایش شدهP. capsici روی کدو بیماری زا بودند اما فلفل به اکثر جدایه ها مقاوم بود.

بیماری لکه قهوه ای برنج یکی از مهم ترین بیماری هایی است که خسارت نسبتا قابل ملاحظه ای به برنج وارد می کند. در طی سال های زراعی 1390-1391، 348 جدایه های Bipolarisاز مزارع برنج (بذرها و برگ ها) و علف های هرز حاشیه مزارع برنج استان های مازندران، گیلان، گلستان، خوزستان و فارس جداسازی شد. با مطالعه خصوصیات مورفولوژیکی جدایه ها شش گونه از جنس مذکور شامل B. oryzae، B. cynodontis، B. spicifera، B. bicolor، B. sorokiniana و B. neergaardii شناسایی شد. گونه B. oryzae با 303 جدایه به عنوان گونه غالب از برگ های دارای علایم لکه قهوه ای و بذرهای برنج و 12 جدایه مشکوک به گونه B. oryzae از سوروف (Echinochloa colona)، پاسپالوم (Paspalum scrobiculatum)، ذرت، موز و گیاه گرامینه ناشناخته جداسازی شد و بقیه گونه های Bipolarisاز برگ ها و بذرهای بدون علایم بیماری لکه قهوه ای برنج جداسازی شدند. تنوع مورفولوژیکی زیادی بین جدایه های B. oryzae از نظر رنگ پرگنه، شکل و ابعاد کنیدیوم ها دیده شد و در چهار گروه مورفولوژیکی قرار گرفتند. با این حال براساس توالی یابی ناحیه rDNA-ITS و ژن gpd جدایه های انتخاب شده به عنوان گونه B. oryzae شناسایی شدند و عامل بیماری لکه قهوه ای برنج در ایران نیز گونه مذکور تشخیص داده شد و گیاهان سوروف، پاسپالوم، ذرت، موز و گیاه گرامینه ناشناخته میزبان های جدیدی برای گونه مذکور معرفی می شوند. هم چنین به مطالعه روابط فیلوژنتیکی گونه های Bipolaris در مطالعه حاضر براساس توالی یابی ناحیه rDNA-ITS و ژن gpdپرداخته شده است.

زردی فیتوپلاسمایی یکی از بیماری های مهم و اقتصادی انگور در بسیاری از نقاط جهان است. در بازدیدهای سال های1391 و1392 علائمی شبیه به علائم زردی فیتوپلاسمایی در مناطق موکاری استان های فارس و لرستان مشاهده و قلمه هایی انتخاب و کشت گردید. عامل زردی با استفاده از سس (Cuscuta campestris Yank.) از موهای حاصل از کشت قلمه های تهیه شده از موهای دارای علائم در استان های فارس و لرستان به پروانش و با استفاده از پیوند از پروانش به پروانش انتقال داده شد و در پروانش های مایه زنی شده تولید علائم بارز بیماری های فیتوپلاسمایی کرد. درآزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) مستقیم با استفاده ازنمونه های پروانش مایه زنی شده و جفت آغازگر P1/P7قطعه مورد انتظار(1800 جفت باز از اپرون ار ان ای ریبوزومی) تکثیر شد. در آزمون پی سی آر دو مرحله ای با استفاده از جفت آغازگر P1/P7 در دور اول و R16F2n/R16R2 در دور دوم نیز قطعه مورد انتظار(1200 جفت باز از ژن آر ان ای ریبوزومیS16) تکثیر شد واز این لحاظ 12 نمونه از 20نمونه مو مبتلا به زردی تاکستان های فارس و لرستان، موهای علائم دار حاصل از کشت قلمه ها و پروانش های مایه زنی مثبت بودند. محصولات پی سی آر مستقیم جدایه های فارس و لرستان همسانه سازی و تعیین ترادف شده و به ترتیب تحت رس شمارهای KF130967 و KF130968 در بانک جهانی ژن ثبت گردیدند. جستجو با برنامه بلاست نشان داد که فیتوپلاسماهای عامل زردی مو در فارس و لرستان در بین ترادف های موجود در بانک جهانی ژن، بیشترین شباهت را با فیتوپلاسماهای گروه آر ان ای ریبوزومی تورم جوانه (Stolbur، 16SrXII)دارند. مقایسه چند شکلی طولی قطعات برشی (RFLP)حقیقی با استفاده ازمحصول PCR دو مرحله ای و RFLP مجازی با استفاده از ترادف ناحیه تکثیری جفت آغازگرR16F2n/R16R2. نشان داد که فیتوپلاسماهای زردی مو در استان های فارس و لرستان از یکدیگر قابل تشخیص نیستند و متعلق به زیر گروهA در گروه 16SrXII می باشند. با تعیین میزان تشابه نوکلئوتیدی و آنالیزتبارزایی با استفاده از ترادف کامل ژن آر ان ای ریبوزومی S16 نیز تعلق فیتوپلاسماهای زردی مو در استان های فارس و لرستان به16SrXII-A تایید شد. مقایسه نقوش حاصل از RFLP مجازی نشان داد که فیتوپلاسمای عامل زوال مو در استان خراسان جنوبی با فیتوپلاسماهای عامل زردی مو در استان های فارس و لرستان و سایر فیتوپلاسماهای گروه16SrXII-A متفاوت است. این اولین گزارش از وجود بیماری زردی فیتوپلاسمایی در غرب و جنوب ایران است. وجود زردی فیتوپلاسمایی مو در نواحی مختلف نشان می دهد که این بیماری در ایران سابقه طولانی دارد.

جنس Trichodermaاز مهم ترین جنس های قارچی در زمینه کنترل بیولوژیک بیماری های گیاهی، افزایش رشد و القای مقاومت در گیاهان به شمار می رود. ارتباط فیلوژنتیکی 81 جدایه متعلق به شش گونه از این جنس (شامل چند جدایه بیوکنترل امید بخش) که از مزارع برنج استان مازندران به دست آمده اند، بر اساس توالی قطعه ای از ژن αtef1بررسی شد. توالی های ژن مذکور در جدایه های مورد آزمایش به همراه توالی های به دست آمده از بانک ژن هم ردیف سازی شدند و تجزیه و تحلیل داده ها با روش های پیوست همسایه ها، پارسمونی بیشینه و تکامل کمینه انجام شد. نتایج نشان داد که جدایه های متعلق به T. harzianum (فراوان ترین گونه شالیزار در این تحقیق) 14 هاپلوتیپ مختلف را تشکیل دادند که در پنج گروه مجزا قرار گرفتند و بنابراین این گونه ی مرکب، بیشترین تنوع ژنتیکی را به نمایش گذاشت. جدایه های T. virens (دومین گونه فراوان مزارع برنج مازندران در این بررسی) فقط در دو هاپلوتیپ گروه بندی شدند. گونه های T. atroviride و T. hamatum با سه و دو جدایه به ترتیب سه و دو هاپلوتیپ را تشکیل دادند. سویه های بیوکنترل متعلق به یک گونه دارای هاپلوتیپ های متفاوتی بودند و همراه با سویه های غیر آنتاگونیست در شاخه های جداگانه ای قرار گرفتند. در نتیجه، هاپلوتیپ منحصر به فردی از αtef1 که به خاصیت آنتاگونیسم مرتبط باشد، بر اساس تجزیه و تحلیل توالی αtef1تشخیص داده نشد. ارتباطی بین هاپلوتیپ و مکان جغرافیایی وجود نداشت و از یک مزرعه، گونه ها و هاپلوتیپ های مختلف جداسازی شدند.

بیماری سفیدک پودری که عامل آن قارچ Podosphaera fusca است، یکی از بیماری های مهم کدوئیان است و رایج ترین روش کنترل آن استفاده از قارچکش ها می باشد. اما اثرات جنبی کاربرد قارچکش ها یافتن روش های دیگری را برای کنترل بیماری ضروری می سازد که از جمله آنها، القای مقاومت در گیاه است. در این پژوهش، اثر عصاره برگ کرفس در کنترل بیماری سفیدک پودری خیار و امکان القای مقاومت سیستمیک در گیاه، در آزمایش های گلخانه ای بررسی شد. بدین منظور، عصاره آبی، استونی و یا متانولی برگ کرفس با غلظت های 1% و 5% (وزن به حجم)، یک روز قبل و یا یک روز بعد از مایه زنی بیمارگر روی برگ های میزبان به کار رفت و سپس شدت بیماری بر اساس تعداد لکه های ایجادشده روی برگ، ده روز پس از مایه زنی محاسبه شد. به علاوه، اثر این عصاره در کنترل سیستمیک بیماری و نیز بر تندش اسپور بیمارگر در سطح برگ مایه زنی شده بررسی شد. هم چنین پس از تیمار اولین برگ حقیقی با عصاره کرفس، اثر آن بر فعالیت آنزیم بتا 1، 3 گلوکاناز در اولین و دومین برگ حقیقی بوته سالم و مایه زنی شده با بیمارگر، بررسی و با شاهد مقایسه گردید. نتایج نشان داد که عصاره برگ کرفس بیماری را به صورت موضعی در برگ اول کنترل کرد و کاربرد عصاره استونی آن در غلظت 5% تاثیر بیشتری در کنترل بیماری داشت. از طرفی کاربرد عصاره تاثیری بر جوانه زنی اسپور قارچ نداشت. بنابراین به نظر می رسد که کنترل بیماری توسط این عصاره، نه به دلیل خاصیت ضدقارچی، بلکه از طریق القای مقاومت در گیاه باشد. از طرف دیگر باتوجه به اینکه تغییرات فعالیت آنزیم بتا 1، 3 گلوکاناز در تیمارهای مختلف هماهنگی مشخصی با کنترل بیماری نشان نداد، به نظر می رسد این آنزیم نقش خاصی در مقاومت به بیماری ندارد و لازم است سایر سازوکارهای احتمالی القای مقاومت بررسی شود.

به منظور مشخص شدن نحوه توارث مقاومت به بیماری زنگ زرد و تعداد ژن های دخیل در مقاومت به بیماری در 17 لاین انتخابی امیدبخش گندم مربوط به اقلیم معتدل کشور، دو لاین انتخابی S-78-11 و S-79-10 از ژنوتیپ های امیدبخش اقلیم گرم و چهار رقم گندم تجارتی داراب 2، نیک نژاد، بهار و استار، تلاقی های بسیاری از این ارقام و لاین ها با رقم حساس استاندارد Avocet S انجام شده و بذرهای F1، F2 و F3 از هر تلاقی تولید شدند. جهت انجام تجزیه ژنتیکی، از عکس العمل دو جمعیتF3 منتج از همه تلاقی ها در مرحله گیاه کامل، یک جمعیت F3 حاصل از تلاقی رقم بهار با Avocet Sدر مرحله گیاهچه ای،والدین و ارقام شاهد نسبت به پاتوتیپ (نژاد) غالب زنگ زرد استان فارس (پاتوتیپ 166E138A+) یادداشت برداری شد. نتایج نشان داد که ژنوتیپ های امیدبخش M-79-4، M-79-5، M-79-13، M-79-18، M-80-13، M-80-20، M-81-5، از اقلیم معتدل، دو ژنوتیپ S-78-11 و S-79-10 از اقلیم گرم و رقم داراب 2 هرکدام دارای یک ژن مقاومت مرحله گیاه کامل و ژنوتیپ های امیدبخش M-79-17، M-80-6، M-80-12، M-81-8، M-81-13، M-81-15 هرکدام دارای دو ژن مقاومت مرحله گیاه کامل هستند. هم چنین واکنش مقاومت ژنوتیپ های امیدبخشM-80-4، M-80-5، M-81-18 و رقم نیک نژاد در مرحله گیاهچه و در مرحله گیاه کامل دلالت بر وجود دو ژن مقاومت داشت. تجزیه ژنتیکی در مراحل گیاهچه و گیاه کامل برای تلاقی رقم بهار با Avocet S نشان دهنده وجود یک ژن مقاومت از نوع گیاهچه ای و نیز یک ژن مقاومت از نوع گیاه کامل برای این ژنوتیپ بود. رقم استار و ژنوتیپ های امیدبخش M-79-13 وM-81-3 فاقد هر گونه ژن مقاومت نسبت به پاتوتیپ مذکور بودند. تجربیات گذشته در ارتباط با زنگ های گندم دلالت بر این دارد که تکیه بر مقاومت های تک ژنی به خصوص از نوع مقاومت مرحله گیاهچه ای که در برخی از ارقام و لاین های امیدبخش تحقیق حاضر نیز تعیین شد کم دوام بوده و اغلب با خطر شکسته شدن مقاومت در یک برهه زمانی کوتاه (5-4 سال) مواجه می باشد. به کارگیری ژن های مقاومت رقم نیک نژاد و لاین های امیدبخشی که دارای دو ژن مقاومت مرحله گیاه کامل بودند در برنامه های اصلاحی جهت تولید ارقام مقاوم به زنگ زرد گندم توصیه می شود.

تورم جوانه یکی از بیماری های مهم گوجه فرنگی در ایران و سایر نقاط دنیا می باشد. دربازدیدهای سال های 89-1388 این بیماری در مزارع گوجه فرنگی استان های خراسان رضوی، خراسان شمالی، آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی، کردستان، کرمانشاه و فارس دیده گردید. علائم بارز بیماری عبارت بودند از کوچک ماندن، ضخیم شدن و رنگپریدگی برگ ها، ارغوانی شدن رگبرگ ها در قسمت زیرین برگ، رشد جوانه های جانبی ساقه، ضخیم شدن ساقه، تغییرات گل شامل بزرگ شدن کاسبرگ هایی که در انتها به هم چسبیده اند و تبدیل کاسه گل به یک جسم کیسه مانند، گل سبزی و فیلودی و عدم تشکیل میوه. عامل بیماری از طریق پیوند از گوجه فرنگی به گوجه فرنگی و به وسیله سس (Cuscuta campestris Yunck.)از گوجه فرنگی به پروانش انتقال داده شد. از پنج بوته گوجه فرنگی دارای علائم تورم جوانه در هر استان، بوته های گوجه فرنگی و پروانش مایه زنی شده، پروانش آلوده به عامل بیماری جاروک لیموترش به عنوان کنترل مثبت و گیاهان سالم گوجه فرنگی و پروانش به عنوان کنترل منفی دی ان ای کل استخراج و دی ان ای هر نمونه از نظر آلودگی فیتوپلاسمایی با روش واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) آزمایش شد. در آزمون پی سی آر مستقیم با استفاده از جفت آغازگرP1/P7 وآزمون پی سی آر دو مرحله ای با استفاده از جفت آغازگرهای P1/P7 (دور اول) وRl6F2n/Rl6R2 (دور دوم) در نمونه های دی ان ای گوجه فرنگی دارای علائم در طبیعت، نمونه های گوجه فرنگی و پروانش مایه زنی شده و دارای علائم و کنترل مثبت قطعات مورد انتظار(به ترتیب 1800 و 1200جفت باز) از دی ان ای ریبوزومی تکثیر شد. هضم آنزیمی محصول پی سی آر دو مرحله ای با استفاده از آنزیم های AluI، RsaI، HinfI، HaeIII، HpaII وTaqI نشان داد که عامل تورم جوانه در استان های کردستان و خراسان شمالی متعلق به گروه جاروک نخود کبوتر(pigeon pea witches’ broom) ا (گروه آر ان ای ریبوزومی 16SrIX) و در استان های خراسان رضوی، آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی، کرمانشاه و فارس متعلق به گروه افژولش شبدر(clover proliferation) یا گروه آر ان ای ریبوزومی16SrVI می باشد. محصول پی سی آر مستقیم نمونه های تورم جوانه در این استان ها با استفاده ازInsT/AcloneTM PCR Product Cloning Kit در پلاسمیدpTZ57R/T و در سویه Escherichia coli DH5a همسانه سازی و تعیین ترادف شد. آنالیز تبارزایی ترادف ناحیه میانی ژن های آار ان ای ریبوزومیS 16و S 23 نیز عامل تورم جوانه گوجه فرنگی در استان های کردستان و خراسان شمالی را با فیتوپلاسماهای گروه16SrIX و عامل تورم جوانه در استان های خراسان رضوی، آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی، کرمانشاه و فارس را بافیتوپلاسماهای گروه16SrVI طبقه بندی کرد. RFLP کامپیوتری با استفاده از ترادف 1200 جفت بازی از ژن آر ان ای ریبوزومی S16 و 17 انزیم برشی علاوه بر تایید نتایج آنالیزهای RFLP فیزیکی و تبارزایی نشان داد که فیتوپلاسماهای طبقه بندی شده با گروه16SrIX متعلق به زیر گروه16SrIX-E و فیتوپلاسماهای طبقه بندی شده با گروه16SrVI متعلق به زیر گروه16SrVI-A هستند. این اولین گزارش از وجود بیماری فیتوپلاسمایی تورم جوانه در استان های خراسان رضوی، خراسان شمالی، آذربایجان شرقی، کردستان و کرمانشاه وگروه بندی فیتوپلاسماهای ردیابی شده در این تحقیق است.

در این تحقیق بیست جدایه قارچ تریکودرما به عنوان عوامل بیوکنترل نماتود ریشه گرهی مورد آزمایش قرار گرفتند. ابتدا جدایه ها در محیط کشت مایع حاوی کیتین کلوئیدال کشت شدند. سه جدایه 125، 126 و Bi 10 از قارچ Trichoderma harzianum بیشترین میزان فعالیت آنزیم کیتیناز را نشان دادند. بررسی شش جدایه از میان قوی ترین و ضعیف ترین جدایه ها از نظر میزان فعالیت کیتیناز در کنترل نماتود در گلخانه نشان داد که همبستگی مثبت بین میزان فعالیت آنزیم کیتیناز و عملکرد در گلخانه وجود دارد. بررسی اثر T. harzianum 125 نیز نشان داد که این جدایه موجب افزایش فعالیت آنزیم های فنیل آلانین آمونیالیاز و پراکسیداز در ریشه گیاه گوجه فرنگی می گردد.

ژن خاموشی پس از ترا نویسی (Post-transcriptional gene silencing =PTGS) به عنوان یک مکانیسم طبیعی که به وسیله آن گیاهان اسیدهای نوکلئیک بیگانه مانند ژنوم ویروس ها را شناسایی و تجزیه می کنند مطرح است. در این مطالعه فرض شد که در مقاومت سیب زمینی همسانه G8107(1) در برابر تجمع PLRV نیز چنین مکانیسمی دخالت دارد. این فرضیه با آزمایش انتقال ویروس از طریق پیوند آزمون شد. در این آزمایش قطعاتی از ساقه های عاری از ویروس سیب زمینی همسانه G8107(1) (به عنوان گیاه مورد آزمایش) و رقم Maris Piper (MP) (رقم حساس به PLRV به عنوان گیاه شاهد) روی ساقه های بوته های سیب زمینی رقم MP آلوده به PLRV پیوند شدند. سپس قطعاتی از ساقه های عاری از ویروس رقم MP روی قطعات حدواسط پیوند زده شدند. نتایج نشان دادند که میزان تجمع PLRV در پیوندک های پذیرنده ای که روی قطعات ساقه همسانه G8107(1) پیوند خورده بودند در مقایسه با پیوندک های پذیرنده پیوند شده روی ساقه های رقمMP تفاوت چشمگیری نداشتند. این امر نشان داد که وجود قطعات ساقه همسانهG8107(1) به عنوان پیوند حدواسط بر تجمع PLRV در پیوندک های پذیرنده پیوند شده روی آنها تاثیری نداشته است. ظاهرا هیچ گونه عامل ژن خاموشی که قادر به تجزیه آر.ان.ای PLRVباشد از همسانه G8107(1)به رقم MP منتقل نشده است. بنابراین عومل ژن خاموشی مفروض یا وجود ندارند یا اگر وجود دارند قابل انتقال نیستند. به هر حال چون ثابت شده است خاموشی ژن قابل انتقال است، به نظر منطقی تر می رسد که مقاومت سیب زمینی همسانه G8107(1) در برابر تجمعPLRV ناشی از ممانعت از تکثیر ویروس باشد تا تجزیه آن پس از تکثیر توسط مکانیسمی شبیه خاموشی ژن.

به بیماری های فیتوپلاسمایی پیچیدگی کلروتیک برگ زردآلو (Prunus armeniaca)، لپتونکروز آلوی ژاپنی (P. salicina) و بیماری های زردی و زوال هلو (P. persica)، آلوی اروپایی (P. domestica) و بادام (P. duilcis) زردی اروپایی درختان میوه هسته دار (ESFY) گفته می شود ((Seemüller et al. 1998a. فیتوپلاسمای عامل این بیماری از نظر فیلوژنتیکی با فیتوپلاسماهای افژولش سیب (AP)، زوال گلابی (PD) و پیچیدگی برگ زرد هلو (PYLR) بسیار نزدیک است. علائم زردی به همراه بازماندگی رشد برگ ها در تابستان 1391 در استان مازندران دیده شد. ده نمونه دارای علائم و دو نمونه فاقد علائم از باغ های مختلف جمع آوری و برای شناسایی عامل بیماری مورد بررسی قرار گرفتند.
دی ان ای کل از نیم گرم بافت رگبرگ اصلی با به کارگیری CTAB(Murray & Thompson 1980) استخراج گردید و ردیابی فیتوپلاسما در نمونه های دی ان ا. توسط پی سی آر دو مرحله ای با جفت آغازگرهای P1/P7 (Deng & Hiruki 1991) (دور اول) و R16F2n/R2 (Gundersen & Lee 1996) و یا fU5/rU3 (Lorenz et al. 1995) (دور دوم) انجام شد. در نمونه های دارای علائم پس از انجام PCR دو مرحله ای یک باند 1200 جفت بازی با آغازگر R16F2n/R2 و یک باند 880 جفت بازی با آغازگر fU5/rU3 تکثیر شد در حالی که در نمونه های سالم باندی دیده نشد. دو محصول پی سی آر از هر یک از جفت آغازگرها به طور مستقیم تعیین توالی شدند. توالی های به دست آمده با توالی های مرجع دربانک جهانی ترادف ها توسط نرم افزار بلاست مقایسه شد. توالی های به دست آمده (شماره های دسترسیKF739403، KF739404، KF739405 و KF739406) به میزان 99 درصد با ‘Ca. Phytoplasma prunorum’ (شماره های دسترسی AJ575108، AJ542545 AJ575111) مشابهت داشتند. با توجه به اطلاعات موجود به نظر می رسد این اولین گزارش از همراهی‘Ca. Phytoplasma prunorum’ با کوتولگی برگ زرد درختان آلو در ایران است.

به منظور شناسایی گونه های مسئول در ایجاد بیماری لکه سیاه کلم برگی در طول تابستان و پائیز سال 1391، نمونه های برگ های آلوده از مزارع تحت کشت کلم در ارومیه جمع آوری شدند و هرکدام داخل پاکت کاغذی جداگانه قرار داده شد و به آزمایشگاه منتقل شد. عمل جداسازی قارچ ها با کشت نمونه های گیاهی روی محیط های کشت PCA (سیب زمینی- هویج-آگار)، PDA (سیب زمینی- دکستروز-آگار) و WA (آب-آگار) انجام گرفت. قارچ های رشد کرده با مشخصات جنس Alternaria با استفاده از روش تک هاگ کردن خالص سازی شدند. شناسایی گونه ها با استفاده از روش توصیه شده سیمونز (Simmons 2007) و در شرایط کنترل شده شامل دمای 25 درجه سلسیوس، دوره نوری/ تاریکی 8/16 ساعته زیر نور سفید فلورسنت، محیط کشت PCA و بعد از گذشت 7-5 روز انجام گرفت. گونه A. interruptaبا مشخصات زیر شناسایی شد: پرگنه ی قارچ به رنگ خاکستری روشن تا قهوه ای روشن بوده و حلقه های متحدالمرکز از رشد و هاگزایی را نشان می دهد (شکل a1). میسلیوم های رویشی هم در داخل و هم در سطح محیط کشت رشد می کنند. هاگ بر اولیه بلند بوده و معمولا بصورت انفرادی تولید می شود. زنجیره های هاگ ها اغلب ساده بوده و تعداد 17-8 هاگ در هر زنجیره تشکیل می شود که 4-3 هاگ موجود در ابتدای زنجیره بزرگ تر از بقیه هاگ ها هستند. هاگ های بزرگ تر بیضی شکل کشیده بوده، 6-4 بند عرضی و 1 بند طولی در عریض ترین بخش خود دارند و اندازه آنها 8-7×45-30 میکرومتر است (شکل b1). هاگ هایی که در بخش بالایی زنجیره قرار دارند تخم مرغی شکل بوده و اندازه آنها 6-4×20-10 میکرومتر است و 3-0 بند عرضی و ندرتا 1 بند طولی دارند (شکل c1). کاهش ناگهانی در اندازه هاگ ها در زنجیره دیده می شود که مهم ترین مشخصه این گونه است. دیواره خارجی هاگ ها صاف تا منقوط است. رنگ هاگ ها قهوه ای تیره و هاگ برها قهوه ای روشن است. آزمون بیماری زایی جدایه های این گونه روی برگ های جدا شده از گیاهان 3 ماهه کلم برگی انجام گرفت. ابتدا برگ های کلم زیر شیر آب شسته شده و توسط اتانول 70 درصد ضد عفونی سطحی شدند. برگ ها داخل ظروف پلاستیکی حاوی یک عدد کاغذ صافی مرطوب قرار داده شدند. حلقه های به قطر 5 میلی متر از حاشیه در حال رشد فعال پرگنه های قارچ (5-4 روزه) برداشته شد و در سطح پهنک برگ قرار گرفت، به طوری که قارچ مماس با سطح برگ باشد. درب ظروف جهت حفظ رطوبت بسته شد و مجموعه در اتاقک رشدی با دمای 25 درجه سلسیوس به مدت یک هفته نگهداری شد. در نمونه های شاهد از حلقه های محیط کشت بدون قارچ استفاده شد. بعد از گذشت این مدت نشانه های بیماری شامل زردی و قهوه ای شدن بافت برگ در اطراف محل مایه زنی دیده شد، در شکل1. پرگنه قارچ (a)، زنجیره هاگ (b) و هاگ بر و هاگ های بزرگ تر (c) در گونه A. interrupta Fig. 1. Fungal colony (a)، conidial chain (b) and conidiophore and larger conidia (c) in A. interrupta شکل2. برگ کلم مایه زنی شده توسط جدایه ای از گونه A. interrupta(a) و تیمار شاهد (b) Fig. 2. Cabbage leaf inoculated with an isolate of A. interrupta (a) and control treatment صورتی که در تیمار شاهد هیچ گونه نشانه ای دیده نشد (اشکال a2 و b2). عمل کشت و جداسازی مجدد قارچ تلقیح شده از برگ های آلوده شده کلم انجام گرفت و لذا اصول کخ در مورد جدایه های این گونه به اثبات رسید. گزارش های قبلی مبنی بر وجود گونه های Alternaria brassicicola، A. brassicae و A. raphaniمرتبط با آلودگی کلم در ایران وجود دارد (Ershad 2009) و این اولین گزارش از وجود و بیماری زایی گونه A. interruptaروی کلم در ایران است.

طی مطالعه روی عوامل بیماریزای شاخه و تنه درختان سیب در باغ های زیر کشت این محصول در شهرستان ارومیه، از درختان سیب رقم گلدن با سن بالای 15 سال و با نشانه های شانکر در بخش تنه و شاخه ها، خشکیدگی شاخه ها، پوسته پوسته شدن سطح شاخه ها و نیز قهوه ای شدن پوست در بخش های آلوده (شکل 1-A)، جدایه هایی پیکنیدیوم دار به دست آمد.خالص سازی جدایه های رشد کرده به روش کشت نوک ریسه انجام گرفت. برای القای تشکیل اندام های باردهی ابتدا جدایه های خالص شده در تشتک های پتری حاوی محیط کشت آب آگار 2 درصد کشت شدند. سپس سوزن های سترون شده کاج در چند محل در سطح محیط کشت قرار داده شدند وتشتک های پتری به مدت 4 هفته در دمای 25 درجه سلسیوس و در زیر نور نزدیک ماورا بنفش (near-UV) و با دوره نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. بعد از گذشت این مدت، پیکنیدیوم ها به فراوانی روی سوزن های کاج تشکیل شدند (Pavlic et al. 2008).
برای شناسایی، معیارهای مختلف ماکروسکوپی مانند رنگ و خصوصیات ظاهری رشدی پرگنه و مشخصات میکروسکوپی مانند رنگ، شکل و ابعاد هاگ، یاخته های هاگ زا و پیکنیدیوم مورد مطالعه قرار گرفتند. برای تکمیل شناسایی مورفولوژیک،بخش ITS در یکی از جدایه های منتخب، با استفاده از آغازگر های ITS1 و NL-4 تکثیر و ترادف یابی گردید. بر اساس مطالعات ریخت شناختی و ترادف یابی بخش ITS، گونه Diplodia seriata De Not.شناسایی گردید (Phillips et al. 2007). جستجوی بلاست توالی به دست آمده با توالی های موجود در بانک ژن (NCBI) شباهت 100 درصدی آن را با توالی های متعلق به گونه D. seriata، تایید نمود. مشخصات توصیفی گونه به این شرح است: میانگین قطر رشد پرگنه در جدایه ها بعد از گذشت 3 روز برابر 80-75 میلی متر بود. بافت پرگنه در ابتدا سفید رنگ، ولی بعد از گذشت سه روز از بخش میانی به رنگ زیتونی متمایل به سبز تا زیتونی خاکستری تغییر یافته و در نهایت بعد از گذشت دو هفته کاملا سیاه رنگ شد. پرگنه دارای حاشیه منظم و با ریسه های هوایی متراکم و فشرده روی محیط کشت بود. کنیدیوماها به صورت پیکنیدیوم، گرد تا بیضی شکل، به قطر تقریبی 380 × 260 میکرومتر، به طور منفرد یا در دسته های چندتایی، به رنگ قهوه ای تیره تا سیاه و فرورفته در بافت تشکیل شده و در شکل[H1] 1. نشانه های شانکر و خشکیدگی شاخه درختان سیب رقم گلدن در باغ های ارومیه (A)، برش طولی پیکنیدیوم (B) و هاگ های (C) گونه Diplodia seriata و آزمون اثبات بیماری زایی گونه Diplodia seriataروی نهال ها (D) و میوه (E) سیب رقم گلدن.
Fig. 1. Canker symptoms on stems of apple Golden cultivar in Urmia orchards (A)، Longitudinal section of pycnidium (B) and conidia (C) of Diplodia seriata and Pathogenicity tests of Diplodia seriata on seedlings (D) and fruits (E) of apple Golden cultivar.
هنگام بلوغ کمی شکوفا است (شکل 1-B). یاخته های هاگ زا بی رنگ، صاف، استوانه ای شکل، در قسمت پایه متورم و به ابعاد 12-7 × 5-3 میکرومتر بودند. هاگ زایی در یک سطح با قطور شدگی حاشیه ای (Periclinal) و یا به صورت پی رست[H2] (Percurrent) و دارای 2 یا 3 حلقه بود. هاگ ها با دیواره ضخیم، با سطح بیرونی صاف، سطح درونی زگیل دار و کاملا مشخص، بیضی تا استوانه ای شکل، با انتهای گرد و در قسمت پایه به طور مشخص تخت و بریده و به ندرت گرد بودند. هاگ ها ابتدا بی رنگ و تک یاخته بوده و سپس قبل از خارج شدن از پیکنیدیوم با تشکیل یک بند عرضی، دو یاخته ای می شدند و رنگ آنها به قهوه ای روشن تا قهوه ای تیره تغییر یافت(شکل 1-C). در برخی موارد، هاگ ها بعد از خروج از پیکنیدیوم دارای 2 یا 3 بند عرضی بودند. ابعاد هاگ ها (31-) 02/22- 6/20 (-12) × (12-) 05/10- 6/9 (- 5/7) میکرومتر و نسبت طول/عرض هاگ برابر 2/2 بود.اثبات بیماری زایی جدایه ها، با مایه زنی آنها روی نهال های دو ساله و نیز میوه سیب رقم گلدن در قالب طرح کاملا تصادفی به همراه تیمار شاهد انجام گرفت. بعد از گذشت 8 هفته، تمام نهال های مایه زنی شده نشانه های شانکر و خشک شدن پوست در اطراف محل مایه زنی را نشان دادند (شکل 1-D)، در آزمون بیماری زایی روی میوه ها، مشخص شد که بعد از گذشت 6 روز، در اطراف محل مایه زنی، نشانه ها به صورت پوسیدگی قهوه ای تیره با حاشیه کاملا مشخص و متمایز از بافت سالم ایجاد شد (شکل1-E) و در برش عمودی از بافت میوه در محل مایه زنی، پیشرفت پوسیدگی به داخل بافت گوشت میوه به طور مشخصی مشاهده شد. جداسازی قارچ از نهال ها و میوه های مایه زنی شده مجددا انجام گرفت. بر اساس بررسی منابع و اطلاعات موجود، این اولین گزارش از وجود و تعیین بیماری زایی گونه D. seriata مرتبط با شانکر درختان سیب در ایران است.

ویروئید کوتولگی رازک از جنس Hostuviroid در مناطق مرکبات کاری سراسر دنیا به عنوان عامل ایجاد کننده اککسیا و زایلوپروز در نارنگی هاC. unshiu Marco.، C. nobilis Lour.) reticulate Blanco،(Citrus و هیبریدهای آنها، اکثر تانجلوها (Macf. C. reticulate × C. paradisi) و تانجورها (C. reticulata × C. sinensis (L.) Osb.) هم چنین لیمو شیرین (C.limettioides Hort. ex Tanaka) شناخته شده و در اکثر آنها کوتولگی و ساقه آبله ای را ایجاد می کند. علائم کاککسیا در نارنگی و دورگه های آن شامل زردی عمومی درخت، صمغ زیر پوست، فرورفتگی هایی در آوند چوبی و تشکیل برجستگی های ریز در سطح کامبیوم پوست که در چوب فرو رفته اند است. شدت علائم بسته به رقم میزبان و استرین ویروئید متفاوت است. به منظور بررسی گسترش بیماری در بعضی گونه های دارای علائم و بدون علائم در مرکبات رایج استان مازندران، نمونه برداری به صورت تصادفی از درختان کلمانتین (C. reticulata Blanco)، ارقام قدیمی نارنگی وازه ساتسوما (C. unshiu) و لیموشیرین که همگی علائم ساقه آبله ای و صمغ زیر پوست را در قسمت بالایی ناحیه پیوند نشان می دادند و درختان لیمو ترش [(C. limon (L.) Burm. f.، Local cultivar)]، گریپ فروت دانکن (C. paradisi Macf.) که بدون علائم بودند صورت گرفت. استخراج RNA از برگ با استفاده ازماده ترایزول (Invitrogen، Carlsbade، CA) انجام شد. نتایج حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز با ترانویسی معکوس RT-PCR)) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ویروئید کوتولگی رازک و الکتروفورز محصولات روی ژل آگاروز 2% نمایانگر وجود قطعات bp300 مورد انتظار ویروئید کوتولگی رازک در همه درختان ساتسوما (20 از 20) و 77% از درختان کلمانتین (19 از 25)، و به ترتیب در 63% (14 از22)، 100% (12 از 12) و 33% (5 از 15) از درختان لیموشیرین، لیموترش و گریپ فروت بود. این درختان فاقد علائم منابع پنهان ویروئید هستند که به نگهداری و گسترش ویروئید کوتولگی رازک کمک می کنند بنابراین استفاده از آزمایش های دقیق ردیابی مولکولی در مناطقی که برنامه های ریشه کنی به کار گرفته شده لازم است. این اولین گزارش آلودگی لیموترش و گریپفروت به ویروئید کوتولگی رازک از ایران است.