پرفیوژن و جداسازی هپاتوسیت از کبد رات

پرفیوژن کبد برای مطالعه متابولیسم ویژه در این ارگان و نیز تهیه هپاتوسیت به کار می رود. برای تهیه هپاتوسیت از کبد رات به طور کلی سه روش مکانیکی، شیمیایی و آنزیمی وجود دارد. هر سه روش دارای مزایا و معایب خاص می باشند. به نظر می رسد تلفیقی از هر سه روش منجر به آسیب کمتر غشاء سلول و بازده بیش تر عمل می شود.

در این مطالعه کبد در محل خود (in situe) کانوله می شود و بر اساس روش شیمیایی- آنزیمی در سه مرحله پرفیوز می گردد. در اولین مرحله کبد توسط مسیر تک مسیری باز توسط محلول کربس- رینگر فاقد کلسیم و منیزیم و حاوی شلاتور کلسیم (EDTA)1 به مدت ده دقیقه پرفیوز گردید. در دومین مرحله کبد توسط محلول کربس- رینگر فاقد کلسیم، منیزیم و شلاتور کلسیم برای شستشوی عروق کبد از شلاتور به مدت یک دقیقه دیگر پرفیوز می گردد. در سومین مرحله کبد توسط کربس- رینگر آنزیم کلاژناز IU/mL) 200) به مدت نه دقیقه توسط سیستم دو مسیری بسته پرفیوز گردید. سلول های هپاتوسیت در غلظت cell/mL 106 9-7 در محیط کربس- رینگر (بافر بیکربنات) در فلاسک های شیشه ای مخصوص تحت جو (5: 95 (O2:CO2، انکوبه شدند. برای بررسی زنده بودن سلول های هپاتوسیت از تست های منع ورود رنگ (تریپان بلو) و از تست تراوش آنزیم سیتوزولی لاکتات دهیدروژناز (LDH) استفاده گردید.

سنجش فعالیت آنزیم لاکتات دهیدروژناز (LDH) به عنوان نشانگر مهم بخش سیتوزولی در سلول هپاتوسیت و محیط انکوباسیون در آغاز و پایان انکوباسیون نشان داد که در ابتدای انکوباسیون حدود 92 درصد و در پایان انکوباسیون حدود 88 درصد آنزیم در سلول احتباس شده و به ترتیب فقط 8 درصد و 12 درصد آنزیم از سلول ها به خارج تراوش شده است. بررسی میکروسکوپی سلول های هپاتوسیت نیز نشان دادند که سلول ها دارای غشاء صاف، بدون چروکیدگی و پار گی و بدون واکوئل می باشند. هنگام رنگ آمیزی سلول ها با رنگ حیاتی تریپان بلو فقط در 5 درصد سلول ها رنگ وارد سلول ها گردید.

یافته های این تحقیق نشان می دهند که تلفیق روش های مکانیکی، شیمیایی و آنزیمی موجب بهبود کیفیت جداسازی سلول های هپاتوسیت از کبد رات می گردد. به طوری که پرفیوژن کبد توسط شلاتور کلسیم به مدت 10 دقیقه و سپس توسط آنزیم کلاژناز به مدت 9 دقیقه موجب تولید حدود mL10سلول با زنده بودن(Viability) بیش از90 درصد می گردد.