Cell Journal (Yakhteh)
Volume:9 Issue: 1, 2007

ارزیابی کاربرد ژن آمیلوژنین به منظور سنجش کایمریسم در نمونه های خون محیطی و یا مغز استخوان بیمارانی است که از دهنده های غیرهم جنس پیوند دریافت کرده اند.
در این مطالعه روش کار PCR مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از پرایمرهای آمیلوژنین، PCR بر روی DNA استخراج شده از سلول های سفید خون محیطی و یا مغز استخوان و در بعضی موارد بر روی زیر گروه های سلولی مانند سلول های T وگرانولوسیت های جدا شده از بیماران دریافت کننده پیوند انجام شد. تعداد 18 بیمار مبتلا به انواع مختلف لوکمی و 12 بیمار با اختلالات هماتولوژیکی غیربدخیم که تحت پیوند سلول های پایه قرار گرفته بودند، توسط مارکرهای آمیلوژنین ارزیابی شدند.
تکثیر PCR این ژن شامل یک باند 106 جفت باز بر روی کروموزوم های X در زنان و دو باند 106و 112 جفت باز به ترتیب بر روی کروموزوم های X وY در مردان است. نسبت قطعات X/Y آنالیز شده در افراد گیرنده مغز استخوان توسط برنامه نرم افزاری دانسیتومتری به عنوان درصد کایمریسم گزارش شد. قدرت تشخیص آزمایش بین 1 تا 2 درصد تشخیص داده شد.
مزایای این روش استفاده از یک جفت پرایمر جهت تکثیر هر دو کروموزوم X و Y است. سنجش بر اساس PCR با استفاده از ژن آمیلوژنین حساس است و به نمونه دهنده وگیرنده قبل از پیوند نیاز نیست. این آزمایش می تواند به طور روتین به صورت تنها و یا در کنار مارکرهای STR برای آنالیز نمونه های مغز استخوان و خون محیطی پیوندهای آلوژن نامتجانس برای تعیین اولیه برقراری یا رد پیوند و مشاهده کنیتیک های پیوند استفاده شود.

بررسی تاثیر دوزهای مختلف رتینوییک اسید همه ترانس بر از سرگیری میوز، بلوغ آزمایشگاهی تخمک های نارس موش و تکوین جنین های حاصل از آن تخمک های نارس از موش های ماده نژاد NMRI در سن شش تا هشت هفته ای در شرایط استریل از تخمدان ها استخراج و به طور تصادفی در گروه های آزمون، شم و کنترل قرار داده شدند. رتینوییک اسید همه ترانس (All- trans Retinoic Acid: t- RA) در دوزهای 25/0، 5/0، 1 و 2 میکرومولار و اتانل مطلق (گروه شم) به عنوان حلال در دوز 2/0 درصد(حجمی/ حجمی) به محیط کشت بلوغ اضافه شد. همه گروه ها جهت فرآیند بلوغ به مدت 24 ساعت داخل انکوباتور قرار داده شدند و تخمک هایی که به مرحله (Metaphase II: MII) رسیده بودند جهت عمل لقاح درکنار اسپرم موش های نر همان نژاد قرارگرفتند. فرآیند ازسرگیری میوز، بلوغ، تشکیل جنین و تکوین آن تا مرحله بلاستوسیست توسط میکروسکوپ معکوس مشاهده و نتایج حاصل با آزمون آماریChi-Square بررسی شد.
میزان از سرگیری میوز در گروه آزمون 25/0 میکرومولار (01/0p<)، آزمون 5/0 و 1 میکرومولار (001/0p<) و در آزمون 2 میکرومولار t- RA (0001/0p<) نسبت به گروه کنترل افزایش معنی داری داشت. بلوغ تخمک در گروه آزمون 1 میکرومولار (01/0p<) و آزمون 2 میکرومولار t- RA (0001/0p<) نسبت به گروه کنترل افزایش معنی داری را نشان داد و تشکیل جنین های دو سلولی 24 ساعته و بلاستوسیست 120 ساعته در گروه آزمایشی 2 میکرومولار t-RA نسبت به گروه کنترل افزایش معنی داری نشان داد (01/0p<). افزودن 2 میکرومولار t-RA به محیط کشت بلوغ حاوی تخمک های نارس، بلوغ و تکوین تخمک های نارس موش را در محیط آزمایشگاهی بهبود می بخشد.

بررسی اثر القایی دپرنیل بر تمایز سلول های استرومایی مغز استخوان به سلول های شبه عصبی و گلیالی در شرایط محیط کشت در این تحقیق (Bone Marrow Stromal Cells: BMSCs) از استخوان فمور وتیبیای موش صحرایی بالغ تهیه شد. سلول ها پس از پنج پاساژ تحت اثر القایی دپرنیل با دوز 8-10 مولار قرار گرفتند و تمایز این سلول ها به سلول های شبه عصبی با روش ایمنوسیتوشیمی ارزیابی شد.
سلول های القا شده توسط دپرنیل (گروه آزمایش) و القا نشده (گروه کنترل) با آنتی بادی های Oligo, GFAP, NF200, NF68 ارزیابی شدند. سلول های تمایز یافته القا شده توسط دپرنیل نسبت با نشانگرهای عصبی واکنش مثبت دادند. برای تعیین درصد, سلول های شبه عصبی و همچنین شبه گلیالی شمارش سلولی صورت گرفت. نتایج بدست آمده موید آن است که 71/82 درصد به سلول های شبه عصبی و 99/25 درصد به سلول های شبه آستروسیتی پاسخ مثبت دادند.
بنابراین می توان نتیجه گیری کرد که BMSCs تحت اثر القایی دپرنیل با دوز 8-10 مولار قابلیت تمایز به سلول های شبه عصبی و شبه گلیالی را در شرایط In vitro دارا است.

تولید کمپلکس آلکالین فسفاتاز-آنتی آلکالین فسفاتاز(APAAP) با هدف به کارگیری آن در یکی از کاربردی ترین روش های تعیین جایگاه آنتی ژن در بافت یا سلول (تکنیک APAAP) و مقایسه آن با محصولات مشابه خارجی در این مطالعه، آنتی بادی های ترشحی دو کلون هیبریدومایی A1G9G3 و A1G8F7 تولید شده در داخل کشور، تغلیظ و خالص سازی شدند و افینیتی آنها مشخص شد. سپس کمپلکس APAAP با غلظت های مناسب از آنتی بادی مونوکلونال ضد آلکالین فسفاتاز (AAP) و آنزیم آلکالین فسفاتاز(AP) تهیه شد و برای رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی(ICC) و ایمونوهیستوشیمی (IHC) در مقایسه با نمونه تجارتی مشابه (شرکت DAKO، دانمارک) استفاده شد.
هر دوکلون سلولی توانایی تولید آنتی بادی مونوکلونال ضدآلکالین فسفاتاز با افینیتی بالا را حفظ کرده بودند و کمپلکس به دست آمده از آنتی بادی مونوکلونال و آنزیم در تکنیک APPAP بسیار کارا و از نظر کیفیت رنگ آمیزی قابل مقایسه با نمونه مشابه خارجی بود.
با توجه به افینیتی مناسب آنتی بادی های مونوکلونال محصول کلون های هیبریدومایی مورد مطالعه و پایداری کمپلکس حاصل از مخلوط آنتی بادی مونوکلونال و آنزیم آلکالین فسفاتاز برای زمان طولانی، می توان از این دو کلون سلولی برای تهیه کمپلکس APPAP در حد نیمه صنعتی و صنعتی کمک گرفت و از آن در رنگ آمیزی های ایمونوسیتوشیمی و ایمونوهیستوشیمی استفاده کرد.

بررسی پتانسیل تمایز به رده های استخوانی، غضروفی و چربی سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان سگ 10 قلاده سگ با متوسط وزن 25-15 کیلوگرم بیهوش شدند و 15 میلی لیتر مغز استخوان از استخوان لگن خاصره هر کدام آسپیره شد. سپس با استفاده از لیمفودکس و ایجاد گرادیان غلظت سلول های تک هسته ای مغز استخوان جدا شد و با تراکم 104*5 سلول بر سانتی مترمربع در محیط DMEM حاوی 15 درصد سرم جنین گاو کشت شد. با انجام چند پاساژ پی درپی، سلول های فیبروبلاستی تخلیص و تکثیر شد و سلول های پاساژ سوم، از لحاظ پتانسیل تمایز به استخوان، چربی و غضروف مورد بررسی قرار گرفت. بدین ترتیب که به مدت 3 هفته در معرض محیط تمایز به استخوان، چربی و غضروف قرار گرفتند و در پایان وقوع تمایز با روش های هیستوشیمی و RT-PCR ارزیابی شد.
به دنبال رنگ آمیزی آلیزارین رد، کشت استئوژنیک قرمز رنگ شد که حاکی از معدنی شدن ماتریکس بود. در این ماتریکس mRNA شاخص بافت استخوانی (کلاژن تیپ I و استئوپونتین) به مقدار زیادی تولید شده بود. همچنین در کشت آدیپوژنیک، قطرات چربی تولید شده به دنبال رنگ اختصاصی اویل رد قرمز شدند. بررسی RT-PCR نشان داد که ژن های شاخص چربی(لیپو پروتئین لیپاز و PPARG2) در این کشت بیان شده است. برش های تهیه شده از کشت کندروژنیک، به دنبال رنگ آمیزی با سافرانین O ارغوانی شد که حاکی از فراوانی گلیکوز آمینو گلیکان در این کشت بود. نتایج RT-PCR نشان داد که در کشت تمایز به غضروف mRNA برخی شاخص های غضروف نظیر کلاژن II و دکورین تولید شده و برخی (ماکرومولکول آگریکان) تولید نشده است.
سلول های فیبروبلاستی جدا شده از مغز استخوان سگ به راحتی به استخوان و چربی تمایز می یابند ولی در تمایز به غضروف، علی رغم تولید ماتریکس غنی از گلیکوزآمینوگلیکان، کلاژن II و Decorin، مولکول اگرکیان ساخته نمی شود.

تعیین وضعیت متیلاسیون پروموتر ژن p15 در نمونه های بافتی بیماران مبتلا به سرطان سلول های سنگفرشی مری در این مطالعه وضعیت متیلاسیون پروموتر ژن p15 در 30 نمونه توموری و10 نمونه بافتی نرمال با تکنیک PCR مختص متیلاسیون (Methylation Specific PCR) بررسی شد. پس از استخراج DNA از بافت ها و هضم آنزیمی، DNA هضم شده به وسیله بی سولفیت سدیم تیمار شد. سپس وضعیت متیلاسیون پروموتر با استفاده ازپرایمرهای متیله و غیرمتیله با حضور فراورده هایPCR مختص این دو حالت مشخص شد. همچنین از DNA استخراج شده از خون افراد سالم به عنوان کنترل منفی و پس از متیلاسیون با آنزیم متیلاز (SssI) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. در ارزیابی نتایج، با استفاده از نرم افزار SPSS، از آزمون دقیق فیشر (Fisher,s exac test) با سطح معنی داری p<0.05 استفاده شد.
بر اساس این مطالعه تمامی 10 نمونه بافت نرمال، غیرمتیله و فقط 5 نمونه از30 نمونه سرطانی (6/16درصد) متیله بودند که این یافته از نظر آماری، با انجام آزمون دقیق فیشر، ارتباط معنی داری را میان متیلاسیون پروموتر ژن p15 و بروز سرطان ESCC نشان نمی دهد.
با توجه به تعداد نمونه های توموری به دست آمده از بیماران مبتلا به سرطان سلول های سنگفرشی مری و نتایج حاصل از آن، به نظر می رسد که میان هیپرمتیلاسیون ژن p15 و بروز این بیماری از نظر آماری ارتباطی وجود ندارد و یا هیپرمتیلاسیون این ژن نقش اصلی در این امر را ایفا نمی کند اما مکانیسم های دیگری باید در مهار این ژن نقش داشته باشند که برای اثبات آن نیاز به تحقیق گسترده تری وجود دارد.

شناسایی ناقلین بیماری دیستروفی عضلانی دوشن با استفاده از تکنیک Real-Time PCR بیماری دیستروفی عضلانی دوشن یک بیماری وابسته به جنس کشنده و غیر قابل درمان است که حدود70 درصد موارد، به علت حذف در اگزون های ژن دیستروفین ظاهر می شود. تنها راه حل ممکن برای پیش گیری از تولد این بیماران، شناسایی ناقلین است ولی تاکنون هیچ یک از روش های آزمایشگاهی توانایی تشخیص همه ناقلین را نداشته است. لذا روش Real-Time PCR به عنوان روشی مناسب و مطمئن برای شناسایی تمام ناقلین دارای حذف انتخاب شده است. وجود حذف در اگزون های 47 و 6 ژن دیستروفین در بیماران 25 خانواده توسط PCR Multiplex تایید شد. سپس با تکنیک Real-Time PCR وبا استفاده از رنگ SYBR Green، ناقلین اجباری و زنان مشکوک به ناقل بودن، مورد بررسی قرار گرفتند. در این کار اگزون 8 فاکتور IX انعقادی هم به عنوان تعدیل کننده استفاده شد. آنالیز اطلاعات بر اساس متد مقایسه ÄÄCT صورت گرفت.
با این روش میزان -ÄÄCT 2در زنان ناقل حدود 21/0±09/1 ودر زنان سالم حدود 1/0±51/0 محاسبه شد و تقریبا تمام زنان ناقل مورد مطالعه با این روش غربال گری شدند.
روش Real-Time PCR روشی حساس، دقیق و نسبتا ارزان برای شناسایی حذف ها و مضاعف شدگی ها و قابل استفاده برای تشخیص ناقلین DMD/BMD در آزمایشگاه های ژنتیک است.

فرایند تمایز سلول های بنیادی از حالت پرتوان به سلول های متعهد و ویژه، مستلزم بروز تغییرات کلی در الگوی بیان ژن در آنهاست که از شناخته شده ترین آنها تغییرات "اپی ژنتیکی" است. مکانیسم های اپی ژنتیکی شامل متیلاسیون DNA، تغییرات در سطح هیستون ها و تنظیمات وابسته به RNAهای غیرکد شونده می شود که به عنوان عوامل اصلی کنترل بیان ژن در طی رشد و نمو سلول مطرح هستند. با توجه به اطلاعات مربوط به توالی ژنوم، بررسی تغییرات اپی ژنتیکی می تواند درک خوبی در خصوص چگونگی امکان بنیادینگی و تمایز هدفمند سلول های بنیادی فراهم کند. در این مقاله مروری به بیان مکانیسم های اپی ژنتیکی موثر در مراحل تکوین جنین و نیز سرنوشت سلول های بنیادی پرداخته خواهد شد.