جستجوی مقالات مرتبط با کلیدواژه « بیان موقت » در نشریات گروه « بیوتکنولوژی و ژنتیک گیاهی »
تکرار جستجوی کلیدواژه « بیان موقت » در نشریات گروه « کشاورزی »-
هرساله میلیون ها نفر از بیماریهای قلبی-عروقی رنج میبرند. درمان های ترومبولیتیک و فیبرینولیتیک نتایجی را در درمان بیماری های قلبی عروقی نشان داده اند. فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA) یک داروی ترومبولیتیک حیاتی است که نقش مهمی در رسیدگی به اختلالات قلبی عروقی دارد. tPA نوترکیب با عنوان آلتپلاز شناخته شده است. رتپلاز (rPA) نسل سوم جهش یافته آلتپلاز، به عنوان یک واریانت بسیار مهم می باشد. هدف از مطالعه حاضر، طراحی سیستم بیان موقت برای انالیز بیان ژن rPA در گیاهان خیار است و الیسیتور متیل جاسمونات برای ارزیابی تاثیر آن در بیان ژن، مورد ازمایش قرار گرفت.برای روش تحقیق، ژن rPA تکثیر و در وکتور ZYMV کلون شد. وکتور نوترکیب ایحاد شده به برگ های گیاه خیار تلقیح شد. و برگ های تلقیح شده در سه، پنج و ده روز پس از تلقیح (DPI) برداشت شدند. علاوه بر این واکنش RT-PCR انجام شد و باند مورد نظر در لاین های تلقیح شده مشاهده شد. و کیفیت پروتئین های رتپلاز بیان شده با ازمایش الایزا مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه نشان داد که حضور متیل جاسمونات منجر به افزایش تولید پروتئین نوترکیب در نمونه های تلقیح شده میشود. قابل ذکر است که بالاترین سطح بیان ژن rPA در نمونه های برداشت شده در روز دهم پس از تلقیح (DPI) و تیمار شده با متیل جاسمونات مشاهده شد که مقدار ان 450.83 ng/µg از کل پروتئین های استخراج شده گیاه بود.برای اولین بار، پروتئین rPA تحت تاثیر الیسیتور متیل جاسمونات با موفقیت در گیاه خیار بیان شد.کلید واژگان: بیان موقت ژن, الیسیتور متیل جاسمونات, فارمینگ, پروتئین نوترکیب, رتپلاز, بیان موقت}Every year, millions of people are suffering from cardiovascular diseases. Thrombolytic and fibrinolytic therapies have shown results in the treatment of cardiovascular diseases and strokes. Tissue plasminogen activator (tPA) is a pivotal thrombolytic drug that plays a crucial role in cardiovascular disorders. The recombinant version of tPA, known as alteplase (rPA), has been designated as a significant breakthrough. Reteplase, a third-generation mutant of alteplase, has also emerged as a notable variant. The objective of the present study was to design a transient expression system to analyze the gene expression of rPA in cucumber plants. Moreover, the effect of elicitor methyl jasmonate (MeJA) was assessed on rPA gene expression. To do this, the rPA gene was amplified and subcloned into the ZYMV vector. The recombinant vector was then inoculated in cucumber leaves, and the transfected leaves were harvested at three, five, and ten days post-inoculation (DPI). An RT-PCR reaction was performed, and the desired band was observed in the inoculated lines. Furthermore, the quantity of rPA protein expression was assessed using ELISA. The results of the study demonstrated that the presence of methyl jasmonate led to an enhancement in the production of recombinant protein in the inoculated samples. The highest level of rPA gene expression was observed in the samples harvested on the tenth day post-inoculation with methyl jasmonate treatment which was 450.83 ng µg-1 of total plant-extracted protein. For the first time, the rPA protein was successfully expressed under the influence of the methyl jasmonate elicitor in the cucumber plants.Keywords: Gene expression, Methyl jasmonate Elicitor, Pharming, Recombinant Protein, Reteplase, Transient expression}
-
این تحقیق بهمنظور بررسی اثر الیسیتور متیل جاسمونات (MeJA) روی تجمع پروتئین های نوترکیب GFP و Anti-VEGFR2 انجام شد. ابتدا به منظور ارزیابی اثر MeJA و روزهای نمونه برداری پس از مایه کوبی روی بیان GFP در کلزا و توتون آزمایش فاکتوریلی در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد. برای تایید رونویسی ژن GFP در سطح RNA، RT-PCR و آزمون qRt-PCR انجام شد. آزمون الیزا برای بررسی اثر الیسیتور روی تجمع GFP و Anti-VEGFR2 انجام شد. به منظور تایید بیان ژن GFP در سطح پروتئین و سپس تعیین بهترین ترکیب تیماری، بیان ژن GFP تحت تاثیر تمام ترکیبات با استفاده از الیزا بررسی شد. سپس بهترین ترکیب تیماری برای بررسی تجمع Anti-VEGFR2 استفاده شد. بیان GFP به طور معنی داری با استفاده از ترکیب M1D10 (بهترین ترکیب تیماری) در هر دو گیاه افزایش یافت. این افزایش در گیاه کلزا بیشتر از توتون بود. بنابراین بهترین ترکیب تیماری برای بیان ژن Anti-VEGFR2 در گیاهان کلزا استفاده شد. در آزمایش qRT-PCR سطوح رونوشت GFP و Anti-VEGFR2 هیچ گونه تفاوت معنی داری بین تیمارهای شاهد و بهینه نشان نداد، اما مقدار پروتئین Anti-VEGFR2 تجمع یافته در تیمارهای بهینه شده بیشتر از کنترل بود. توضیح ساده برای تجمع افزایش یافته نانوبادی Anti-VEGFR2 و GFP کاهش بیان پروتئین RuBisCO در برگ ها و در نتیجه افزایش دسترسی منابع متابولیکی و سلولی برای تولید پروتئین های با فراواتی کمتر (از جمله پروتئین های نوترکیب) میباشد. این تحقیق نشان داد که الیسیتور تجمع هر دو پروتئین نوترکیب GFP و Anti-VEGFR2 را افزایش می دهد.کلید واژگان: الیسیتور, بیان موقت, پروتئین نوترکیب, زراعت مولکولی}This study was performed to investigate the effect of methyl jasmonate (MeJA) elicitor on green fluorescent protein (GFP) and Anti vascular endothelial growth factor (Anti-VEGFR2) proteins accumulation. A factorial experiment based on completely randomized design (CRD) was performed primarily to evaluate the effect of MeJA and days after inoculation on GFP expression in Brassica napus and Nicotiana benthamiana. RT-PCR and qRt-PCR assay was performed for GFP gene transcription confirmation at mRNA level. ELISA was done to investigate effect of the elicitor on GFP and Anti-VEGFR2 accumulation. The optimum treatment combination was then used to check Anti-VEGFR2 accumulation. GFP expression was significantly enhanced using M1D10 combination (the best treatment combination) in the two plants. This increase was greater in Brassica napus than in Nicotiana benthamiana. GFP and Anti-VEGFR2 transcript levels showed no significant differences between the optimized and control treatments in the qRT-PCR experiment, but the quantity of Anti-VEGFR2 protein accumulated in optimized treatments was higher than in control. A simple explanation for the improved accumulation of GFP and Anti-VEGFR2 would be a low ‘sink pressure’ on amino acid pools towards RuBisCO biosynthesis in RuBisCO-depleted leaves, and a resulting increased availability of metabolite and cellular resources for the production of less abundant (e.g., recombinant) proteins. This research showed that MeJA elicitor increased the accumulation of both proteins.Keywords: Elicitor, GFP, Molecular farming, Recombinant Protein, Transient expression}
-
هدف
هدف از این تحقیق همسانه سازی و بیان پروتیین نوترکیب کیموزین و پروکیموزین در گیاه توتون با استفاده از ناقل ویروس موزاییک تنباکو و خالص سازی پروتیین تولید شده بود.
مواد و روش هاتوالی پروکیموزین بزی از پایگاه داده NCBI دریافت و براساس ترجیح کدونی گیاه توتون بهینه سازی گردید. سپس با طراحی آغازگرهای مختلف ژن پروکیموزین و کیموزین تکثیر و در ناقل های دوتایی (باینری) و ویروسی همسانه سازی و به باکتری آگروباکتریوم تومه فاشینس انتقال داده شد. با روش آگرواینفیلتراسیون باکتری حامل ناقل های دوتایی و ویروسی به برگ های گیاه توتون تزریق گردید. روش وسترن بلاتینگ به منظور بررسی بیان پروتیین مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت نسبی پروتیین ها در تشکیل لخته مورد بررسی قرار گرفت.
نتایجزمانی که ژن پروکیموزین با استفاده از ناقل های دوتایی در گیاه توتون بیان گردید، فقط یک باند ضعیف در پروتیین کل استخراج شده مشاهده گردید، ولی زمانی که ژن کیموزین در ناقل دوتایی بیان گردید، در پروتیین محلول نیز باند مشاهده گردید. استفاده از ناقل های ویروسی باعث نکروزه شدن برگ های گیاه توتون گردید و نتایج مشابهی نیز با ناقل های دوتایی بدست آمد به طوری که زمانی که ژن پروکیموزین بیان گردید فقط یک باند در پروتیین کل، ولی زمانی که کیموزین بیان گردید علاوه بر پروتیین کل در پروتیین محلول استخراج شده نیز باند مشاهده گردید. بیشترین میزان بیان با استفاده از سازه ژنی TMVαchymosinhyFC بدست آمد که پروتیین خالص شده دارای فعالیت تشکیل لخته U 8/16 در هر گرم برگ تر بود.
نتیجه گیریاگرچه استفاده از ناقل های ویروسی و بیان موقت می تواند روش ارزان، سریع و موثری برای تولید پروتیین های نوترکیب باشد ولی در تحقیق حاضر نکروزه شدن و مشکلات احتمالی گیاه توتون با کل یا بخشی از ژن پروکیموزین باعث کاهش سطح بیان کیموزین گردید، که تعیین دلایل احتمالی و راه های رفع آن ها نیازمند مطالعات بیشتر می باشد.
کلید واژگان: بیان موقت, پروکیموزین, کیموزین, ناقل ویروسی}ObjectiveThe aim of present study was transient expression and purification of recombinant caprine chymosin and prochymosin in N. benthamiana leaves using plant binary vectors and tobacco mosaic virus (TMV) vector.
Material and MethodsThe caprine prochymosin gene sequence was obtained from NCBI gene bank and optimized at codons for preferential expression in tobacco leaves. The chymosin and prochymosin genes were introduced into the plant binary and viral vectors. Immunoblotting analyses were conducted to demonstrate expression of chymosin and prochymosin, and the expression level was quantified by milk clotting activity test.
ResultsResults indicated that N. benthamiana leave cells cannot process prochymosin correctly and only a weak band observed in extracted total proteins (TPs) which showed no milk clotting activity while leaves infiltrated by p20αchymosin showed a band with chymosin molecular weight and slightly showed milk clotting activity. TMV-based recombinant prochymosin and chymosin expression showed necrosis after 3 days post infiltration (dpi) in agro-infiltrated leaves and after 5 days, leaves completely dried and necrotized. Blotting analysis showed only a band with right molecular weight in TSPs extracted N. benthamiana leaves infiltrated by TMVαchymosin. Moreover, we subcloned chymosin which expanded with a N-terminal barley alpha amylase signal peptide and a C-terminal hybrid Fc tag which labelled as TMVαchymosinhyFc. The expression level increased gradually from 2 to 5 days after infiltration from 3.3 U/g FW to 16.8 U/g FW but after 5-day leaves necrosis started and expression level reduced gradually.
ConclusionViral vectors and transient expression can be a cheap, fast and effective method to produce a huge amount of recombinant proteins but it seems chymosin production still needs more research and find the N. benthamiana cells problem with chymosin which leads to necrosis and reduce the expression level for large scale production.
Keywords: Chymosin, Prochymosin, Transient expression, Viral vector} -
فاکتور رشد فیبروبلاست بازی (bFGF) کاربردهای درمانی بالقوه ای به عنوان یک عامل درمانی برای ترمیم بافت، ترمیم زخم های پوستی و بهبود بیماری های عصبی دارد.در این پژوهش، پس از بهینه سازی تمام مراحل انتقال موقت توسط آگروباکتریوم، بیان ژن bFGF در برگ های شنبلیله آلوده شده با سویه های مختلف آگروباکتریوم تحت شرایط بهینه شامل غلظت 200 میکرومولاراستوسیرینگون، غلظت باکتریایی (OD) 1.0 OD600 و فاصله زمانی 10 روز پس از اینفیلتراسیون مورد بررسی قرار گرفت. بیان موقت در برگ های تزریق شده شنبلیله توسط آنالیز qRT-PCR تایید شد تولید پروتیین نوترکیب bFGF نیز توسط آنالیز وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت. علاوه بر این، غلظت های پروتیین نوترکیب bFGF تولید شده توسط آنالیز الایزا در همه نمونه های برگی تزریق شده اندازه گیری شد. اگر چه تفاوت معنی داری در سطوح نسبی رونوشت bFGF در بین نمونه های مختلف وجود نداشت اما سطوح تجمع پروتیین نوترکیب bFGF به طور معنی دار تحت تاثیر سویه های اگروباکتریوم قرار گرفت که احتمالا به علت خاموشی ژن پس از رونویسی است. بیشترین پروتیین تولید شده bFGF در سویهEHA105 و به مقدار 85/3 نانو گرم در هر گرم وزن برگ به دست آمد. بیشترین پروتیین تولید شده bFGF در سویهEHA105 و به مقدار 3.85 نانو گرم در هر گرم وزن برگ به دست آمد.کلید واژگان: اگروباکتریوم, فاکتور رشد فیبروبلاستی, فعالیت ژن بتاگلوکورونیداز, سنجش هیستوشیمیایی, بیان موقت}The basic fibroblast growth factor (bFGF) has the potential applications as a therapeutic agent for tissue repair, skin wound healing, and recovery of the neurodegenerative diseases. In this study, after the optimization of all steps in transient transformation by Agrobacterium, the bFGF gene expression was examined in fenugreek leaves infiltrated with different Agrobacterium strains under optimal conditions. These include the AS concentration of 200 μM, bacterial density (OD) of 1.0 OD600, and co-cultivation time for 10 days. The transient expression of the insert was verified in the infiltrated leaves by qRT-PCR analysis. The production of the recombinant bFGF protein was also rectified by Western blot analysis. In addition, the production titers of the recombinant bFGF protein were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in all infiltrated leaf samples. Although, there were no significant differences in relative levels of bFGF transcript among the different treatments, but the accumulation levels of recombinant bFGF were significantly affected by Agrobacterium strains. It is possibly due to the post-transcriptional gene silencing. The highest accumulation level of recombinant protein was obtained in leaf samples infiltrated by the EHA105 strain, estimated to be about 3.85 ng bFGF g−1 FW.Keywords: Agrobacterium, Fibroblast growth factor, GUS activity, Histochemical assay, Transient expression}
-
هدف
فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (rtPA) یکی از مهم ترین داروها در درمان بیمارهای قلبی است. این دارو به صورت پروتئین نوترکیب در سیستم های بیانی تولید می شود که هزینه های تولید بسیار بالایی دارد. سیستم بیان موقت به دلیل بیان زیاد، سرعت بالا، هزینه پایین و عدم تاثیرپذیری مکانی جهت بیان پروتئین بسیار مناسب می باشد. با این وجود مشخص شده است که خاموشی پس از رونویسی حاصل از کمپلکس RISC بر میزان بیان پروتئین نوترکیب تاثیر می گذارد. یکی از مهم ترین سرکوب کنندههای خاموشی RNA شناخته شده در گیاهان، پروتئین P19 میباشد که از طریق میل ترکیبی زیادی که با siRNA دو رشتهای دارد به آن متصل می گردد و آن را تجزیه می کند و مانع خاموشی ژن می گردد. هدف از مطالعه حاضر بررسی تاثیر بیان هم زمان ژن P19 بر بیان ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (rtPA) در سطح رونویسی و پروتئین در گیاه توتون Nicotiana benthamiana بود.
مواد و روش هادر تحقیق حاضر میزان بیان ژن rtPA در سطح رونویسی و پروتئین مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق از تزریق هم زمان اگروباکتریوم حاوی ناقل دوتایی pCAMBIA1304-rtPA و اگروباکتریوم حاوی ناقل pCAMBIA1304-P19 در مقایسه با اگروباکتریوم حاوی تنها ناقل بیانی pCAMBIA1304-rtPA استفاده شد. نمونه های برگی در روزهای 4، 7 و 10 روز پس از تلقیح با آگروباکتریوم تهیه شدند. سپس میزان رونویسی و پروتئین با استفاده از آزمون ReaTime PCR و الایزا محاسبه شد.
نتایجنتایج آزمون Real Time PCR حاکی از افزایش 34 درصد میزان رونویسی ژن rtPA در حضور P19 نسبت به شاهد بود. بیشترین میزان رونویسی از ژن های P19 و rtPA باگذشت چهار روز از تلقیح گیاهان با اگروباکتریوم حاصل شد. نتایج الایزا نشان داد که میزان بیان پروتئین rtPA در حضور ژن P19 در روز هفتم و دهم پس از تلقیح به ترتیب 89 و 84 میکروگرم بر گرم وزن تر برگ بود که در مقایسه با شاهد به ترتیب به میزان 12 و 15 درصد بیشتر بود.
نتیجه گیری کلینتایج نشان داد که کاربرد P19 علاوه بر سرکوب خاموشی ژن، می تواند برای دست یابی به بیان در سطح بالا موثر باشد.
کلید واژگان: اگروباکتریوم, بیان موقت, زراعت مولکولی, سرکوب کننده خاموشی ژن}ObjectiveTissue plasminogen activator is one of the most important drugs in the treatment of heart disease. This drug is produced in the expression system as a recombinant protein that has high production costs. Transient expression system is very suitable for protein expression because of its high expression, high speed, low cost and no spatial effect. Post-transcriptional silencing has been shown to affect expression levels. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of simultaneous expression of P19 silencing suppressor gene on transient expression of recombinant tissue plasminogen activator (rtPA) at transcriptional and protein levels in Nicotiana benthamiana.
Material and methodsTo serve this purpose, the expression proportion of injected Agrobacterium tumefaciens containing a binary vector pCAMBIA1304-rtPA with agrobacterium containing pCAMBIA1304-P19 have been studied comparison with the expression level from Agrobacterium containing only the binary vector pCAMBIA1304-rtPA. Leaf samples were prepared on 4, 7, and 10 day post-inoculation with Agrobacterium. Transcription and then protein levels were calculated using the Real Time PCR and ELISA tests.
ResultsThe results of Real Time PCR test showed that rtPA transcript increased in the presence of P19. Also, 4 days after plant inoculation, the highest transcript levels were obtained from p19 and rtPA genes. ELISA results showed that the expression of rtPA protein in the presence of P19 was 89 and 84 µg.g-1 leaf weight at the 7 and 10 day after inoculation, respectively. This expression was 12 and 15% higher than of when agrobacterium-containing pCAMBIA1304-rtPA vector alone was used, respectively.
ConclusionThe results showed that the use of transient expression method could be a suitable method for rtPA protein production.
Keywords: Agrobacterium, Transient expression, Molecular Farming, Silencing Suppressor} -
از گیاهان تراریخت می توان به جای بیوراکتور برای تولید ارزان مواد شیمیایی و دارویی استفاده کرد. در سال های اخیر، ناقلان ویروسی به طور گسترده در نقش ابزار بیوتکنولوژی موفق برای بیان طیفی گسترده از پروتئین های نوترکیب در گیاهان توسعه یافته عمل می کنند. مزیت کاربرد ناقلان ویروسی به سبب نظام همانندسازی خودکار، افزایش سطح بیان ژن در زمانی کوتاه است. جستار پیش رو، نخستین مطالعه ناقل بر پایه TuMV در گیاه تربچه به شمار می رود که از ناقل بر پایه ویروس موزاییک شلغم (TuMV)، برای تبیین موقت پروتئین فلورسنت سبز (GFP) در گیاه تربچه استفاده کرده است. برگ ها به صورت مکانیکی به کمک خراش با کربوراندوم تلقیح، پس از گذشت 14 روز برای ارزیابی برداشت شدند و انتقال و بیان پروتئین موردنظر با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت، RT-PCR، SDS-PAGE و دات بلات تایید گردید. آنالیز الایزا از بیان فراوانی پروتئین GFP در گیاهان تلقیح شده نسبت به فرم وحشی حکایت دارد. نتایج پژوهش نشان می دهد که ناقل بر پایه TuMV کارایی بیشتری برای بیان پروتئین خارجی در گیاه تربچه دارد.کلید واژگان: بیان موقت, ناقل ویروسی, GFP, تربچه}It is possible to use transgenic plants, as bioreactors, for the production of recombinant inexpensive chemicals and drug components. Transient gene expression is an appropriate alternative to stable transformation because it allows an inexpensive and rapid method for expression of recombinant proteins in plant tissues. In recent years, plant viral vectors have been increasingly developed as successful biotechnological tools for the expression of a wide range of foreign proteins in plants. Plant viruses-based vectors are useful because of the autonomous replication and the high level of gene expression in a short time. Here, we have used a vector derived from an infectious turnip mosaic virus (TuMV) for transient expression of the jellyfish green fluorescent protein (GFP), as a model heterologous protein, in radish plant. The GFP ORF was inserted between NIb and CP sites under control of CAMV35S promoter. The leaves were inoculated using surface scratch by carborundum and harvested 14 days after inoculation for analysis. The visualization of GFP fluorescence in leaf disks from inoculated plants using fluorescence microscopy demonstrated gene transformation and systemic infection. Expression of the desired protein were confirmed by RT-PCR, SDS-PAGE and Dot blotting analysis. The quantitative values of GFP in different inoculated leaves were compared by ELISA assay using an anti-GFP antibody. The results showed high level of expression of GFP protein in leaves of inoculated plants compared with wild type. The results demonstrated that the TuMV-based vector has high efficiency for the expression of the foreign protein in the radish plant. This is the first examination of TuMV-based vector in radish.Keywords: GFP, Radish, Transient expression, Viral vector}
-
گیاهان به دلایل متعددی به عنوان بیوراکتورهای ارزشمند برای تولید انواع پروتئین های نوترکیب (به ویژه آنتی بادی های مونوکلونال و...) می توانند مورد بهره برداری قرار گیرند. استفاده از ناقل های ویروسی گیاهی برای بیان موقت، یک استراتژی مفید برای تولید پروتئین های مهم دارویی از قبیل آنتی بادی ها در مقیاس بالا و در یک دوره زمانی خیلی کوتاه پیشنهاد می شود. امروزه، سرطان دومین عامل مرگ و میر در جامعه بشری است. شواهد قانع کننده نشان می دهد که فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF) به دلیل نقش ضروریش در رگزایی یک هدف مهم برای درمان سرطان می باشد. در این مطالعه قطعات مختلف نانوبادیAnti-VEGF (Nb42) به طور موقت تحت کنترل راه انداز قوی ویروسی در گیاه کدو با استفاده از ناقل ویروسی مبتنی بر ZYMV بیان گردید. این قطعات شامل توالی معمولی نانوبادی (Nb42I) و توالی بهینه شده نانوبادی برای بیان در گیاه (Nb42II) بودند. پس از مایه کوبی گیاهان، حضور رونوشت های قطعات مختلف ژنی Nb42 در گیاهان مایه کوبی شده کدو با استفاده از آزمون RT-PCR شناسایی گردید. همچنین بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از آزمون های لکه گذاری نقطه ای، SDS-PAGE، لکه گذاری وسترن و الایزا تائید گردید. بر اساس نتایج الایزا، میزان بیان نانوبادی Nb42Iو Nb42II به ترتیب 2 و 8/6 میکروگرم در هر گرم بافت برگی بود. در مجموع، نانوبادی نوترکیب Nb42 می تواند به طور موثر در گیاه کدو بیان گردد و سیستم بیانی مبتنی بر ZYMV یک سیستم تولیدی مناسب برای بیان پروتئین های نوترکیب در گیاهان خانواده کدوئیان خواهد بود.کلید واژگان: بیان موقت, بهینه سازی کدونی, زراعت مولکولی, ناقل ویروسی, نانوبادی}Plants can be exploited for the production of various recombinant proteins as valuable bioreactors because of many reasons. The use of plant viral vectors for the transient expression offers as a useful strategy for the large-scale production of proteins with pharmaceutical importance, such as antibodies within a very short time period. Today, cancer is the second cause of death in human society. Compelling evidence suggests that vascular endothelial growth factor (VEGF), due to its essential role in angiogenesis, is a critical target for cancer treatment. In This study, Anti-VEGF (Nb42) nanobody different fragments were transiently expressed under the control of a viral strong promoter in cucurbit plant using ZYMV-based viral vector. These fragments included natural nanobody sequence (Nb42I) and optimized nanobody sequence (Nb42II) for expression in plant. After inoculation of plants, the presence of transcripts of the Nb42 gene fragments in cucurbit inoculated plants was detected by using RT-PCR. Also, the recombinant protein expression was confirmed by Dot blotting, SDS-PAGE, Western blotting and ELISA. Based on the ELISA results, the expression level of Nb42I and Nb42II nanobody fragments was 2 and 6.8 μg/g of leaf tissue respectively. Taken together, recombinant Nb42 nanobody could be efficiently expressed in cucurbit plant and ZYMV-based expression system would be an appropriate platform for production of recombinant proteins in cucurbit plants.Keywords: Transient expression, Codon optimization, Molecular farming, Viral vector, Nanobody}
-
ژن های اثرگذار (effector genes) نقش کلیدی را در برهم کنش میان بیمارگر و گیاه ایفا می کنند. جستجوی همولوگ ژن های اثرگذار از زمان گزارش تعدادی از این ژن های در فرم اختصاصی Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) در دیگر فرم های اختصاصی آغاز شده است. اخیرا، با بهره گیری از روش های مبتنی بر بیوانفورماتیک همولوگ ژن اثرگذار Fol-SIX1 از فرم اختصاصیFusarium oxysporum f. sp. melonis (Fom) گزارش شده است. در این مطالعه آنالیز عملکرد ژن Fol-SIX1 با هدف بررسی برهمکنش این ژن با ارقام افتراقی ملون حامل ژن های مقاومت، انجام شد. توالی کدکننده ژن Fol-SIX1 از سازه pTS1 طی سه مرحله در وکتور جفتی pCAMBIA3301 همسانه سازی شد و با استفاده از روش های کلنی PCR و هضم آنزیمی تایید گردید. صحت توالی سازه بیانی pCaS1 با توالی یابی دوجهته بوسیله آغازگرهای PSh4-F2 و PSh51-Rمورد بررسی قرار گرفت. روش بیان موقت مبتنی بر تزریق اگروباکتریوم برای بیان ژن Fol-SIX1 در برگ ارقام ملون استفاده شد. آنالیز کارکرد ژن Fol-SIX1 با تزریق سویه LBA4404 حامل سازه بیانی pCaS1 در برگ ارقام ملون انجام شد. برگ ارقام Charentais T (Ch-T)و Charentais Fom2 (Ch-Fom2) پس گذشت 24 ساعت در ناحیه تزریق علائم سبزخشکی ناشی از مرگ سلولی در پاسخ به بیان موقت ژن Fol-SIX1 بروز یافت در حالیکه در ارقام Charentais Fom1(Ch-Fom1) و BG5384 (BG) تا 48 ساعت پس از تزریق نیز پاسخی بروز نیافت.
کلید واژگان: تزریق اگروباکتریوم, ژن های اثرگذار, ژن Fol, SIX1, بیان موقت}Melon Vascular wilt caused by a soil-borne pathogen، Fusarium oxysporum f. sp melonis (Fom) is a distractive disease. The use of resistant cultivars is an effective way for controlling this fungus. Clear view about the interaction between virulence and resistant genes could provide applicable knowledge to design breeding programs. Fungus effector genes play a critical role during the plant-pathogen interactions. Exploring for the homologous of effector genes in different formae speciales started since some effector genes have been reported from Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol). Recently، using bioinformatics assisted approach a homologous Fol-SIX1 effector gene has been reported from Fom. Here we performed a functional analysis study to reveal interactions between Fol-SIX1 and the melon differential varieties harboring defined R genes. Coding sequence of Fol-SIX1 from the pTS1 construct was subcloned in the pCAMBIA3301 binary vector in three steps and confirmed by colony PCR and digestion analysis. The accuracy of the expression construct، pCaS1 was evaluated by bidirectional sequencing using the PSh4-F2 and PSh51-R primers. Agroinjection-mediated transient expression approach was used to express Fol-SIX1 in leaves of the melon varieties. Functional analysis of Fol-SIX1 was performed by agroinjection of LBA4404 carrying pCaS1 into the leaves of melon lines. the leaves of Ch-T and Ch-Fom2 varieties developed a green dried symptom in response to transiently expressed Fol-SIX1 at 24 hours post injection (hpi)، while Ch-Fom1 and BG lines did not responsive to the infection until 48 hpi.Keywords: Agroinjection, Effector gene, Fol, SIX1, Transient expression} -
بیان موقت یک ژن اثرگذار در بیماری زایی (effector) در گیاه میزبان با استفاده از اگرواینجکشن، یک روش قابل قبول برای بررسی نقش ژن در بیماری زایی است. در این مطالعه تاثیر دو سویه اگروباکتریوم بر چهار رقم استاندارد و دو رقم محلی خربزه در بررسی بیان موقت مورد ارزیابی قرار گرفت. سازگاری سویه های LBA4404 و GV3101 به وسیله تزریق سلولهای باکتری به برگ ارقام خربزه تعیین شد. زنده مانی سلول های اگروباکتریوم تزریق شده در بافت برگ به وسیله ارزیابی بیان پروکاریوتی ژن GUS 24 ساعت پس از تزریق تعیین شد. سویه LBA4404 پس از انتقال ناقل pCAMBIA3301 دارای ژن GUS اینترون دار به عنوان کنترل مثبت برای تایید بیان موقت این ژن در سلول های گیاه استفاده شد. انتقال ناقل های pBI121 و pCAMBIA3301 به سویه LBA4404 با روش کلنی PCR با آغازگر های PSh3-F/R تایید شد. راندمان بیان موقت در برگ های ارقام خربزه، 48 ساعت پس از اگرواینجکشن سویه LBA4404 حامل ناقل pCAMBIA3301 به وسیله سنجش هیستوشیمیایی ژن GUS مشخص شد. برگ های تزریق شده با سویه LBA4404 دارای ناقل pBI121 فعالیت ژن GUS را نشان دادند که تایید کننده زنده بودن سلول های اگروباکتریوم در برگ ارقام خربزه بود. تمام ارقام ژن GUS را به صورت موقت با استفاده از اگرواینجکشن پس از گذشت 24 ساعت بیان کردند. این نتایج می تواند در مطالعات آینده به منظور بررسی عملکرد ژن های اثرگذار منتخب در برهمکنش با ارقام استاندارد خربزه مورد استفاده قرار گیرد.کلید واژگان: ارقام استاندارد خربزه, اگروباکتریوم, بیان موقت, سنجش GUS}Transient expression of a candidate effector gene in host plants following Agroinfiltration is a useful method to investigate the role of the gene in pathogenecity. In this study, the effects of two Agrobacterium tumefaciens strains on four standard melon lines and two Iranian melon cultivars were investigated to establish transient expression in melon. Compatibility of the LBA4404 and GV3101 strains was defined by injection of the bacterial suspensions into the leaves of cultivars. Viability of the injected Agrobacterium strain cells in leaf tissues was evaluated 24 hours after injection by prokaryotic GUS reporter gene assay. The LBA4404 strain harboring the pCAMBIA3301 vector containing an intron-GUS reporter gene was used to confirm eukaryotic GUS expression in the plant cells. The LBA4404 strain was transformed by the pBI121 and pCAMBIA3301 expression vectors and transient transformation was confirmed by colony PCR technique using the PSh3-F/R primers. The efficiency of transient transformation of the melon leaves was evaluated 48 hours after Agroinjection of the LBA4404 strain containing pCAMBIA3301 by the histochemical GUS assay. The leaves that were injected by LBA4404 harboring pBI121 showed GUS activity. All the melon cultivars transiently expressed the GUS reporter gene 24 hours after Agroinjection. These findings could be used in the future studies to evaluate function of candidate effector genes in interaction with standard melon lines.Keywords: Agroinjection, GUS assay, Melon, Transient expression}
-
از آنجاکه انتقال دایم ژن و تولید گیاه تراریخته به ویژه در گیاهان چند ساله مانند بادام لازمه ی صرف وقت و هزینه است، بهینه سازی عوامل مختلف اثر گذار در تراریزش گیاهان، مورد توجه قرار می گیرد. بیان موقت ژن با استفاده از اگروباکتریوم (اگرواینفیلتریشن) یک راهکار مفید برای بررسی عملکرد ژن در سیستم های بیانی متفاوت است. از آنجاکه بهینه کردن فاکتورهای موثر در روش های تراریزش لازمه برنامه های انتقال ژن است، این پژوهش با هدف توسعه یک سیستم کارآمد برای بیان موقت به واسطه اگروباکتریوم در برگ های بادام، جهت پیش بینی سریع عملکرد سیستم های تظاهر و پروتئین نوترکیب در بادام انجام شد. ژن گزارشگر لیکیناز برای ارزیابی عواملی که سطح بیان موقت را تحت تاثیر قرار می دهند، به کار برده شد. مزیت اصلی استفاده از این ژن، سادگی کار، حساسیت بالا و ایمنی زیستی آن است. سه سیستم تظاهر مختلف حامل ژن لیکیناز، که تحت تاثیر عناصر تنظیمی متفاوت قرار داشتند به واسطه دو سویه اگروباکتریوم LBA4404 و GV3501 با استفاده از سرنگ بدون سوزن به برگ های رقم های مامایی و شاهرود 12 بادام انتقال داده شد. بعد از سه روز میزان پروتئین فعال اندازه گیری شد. آزمون های آماری نشان داد که بیشترین میزان تولید پروتئین در برگ های رقم مامایی با استفاده از سیستم تظاهری که موجب تجمع پروتئین در شبکه آندوپلاسمی می شود، با کاربرد سویه LBA4404 به دست می آید. از این رو سیستم تظاهر مربوطه و سویه باکتری LBA4404 و رقم مامایی بادام جهت دستیابی به بادام تراریخته پیشنهاد می شود.کلید واژگان: اگرواینفیلتریشن, اگروباکتریوم, بادام, بیان موقت, سیستم تظاهر}Since permanent transfer of genes and transgenic plant production, particularly in perennial plants such as almonds are time and cost consuming, optimization of various factors affecting the transgenic plants is critical. Transient genetic expression using Agrobacterium (Agroinfiltration) in plant is a useful tool to study gene function indifferent gene expression systems. Since optimization of factors that could affect the transgenic methods is necessary for gene transfer programs, Because This study was aimed at developing an efficient system for transient expression via Agrobacterium in almond leaves for rapid prediction of systems performance. Here the lichenasereporter gene was usedto assessthe parametersinfluencing thelevel oftransient expression. The main advantagesof using thisgene includeeasy operation, high sensitivity and biosafety. Three different constructs carrying lichenase gene and differentregulatoryelementswereinfiltrated intoleaves ofmamaei and shahrood 12cultivars,by two Agrobacteriumstrain, LBA4404 andGV3501,using syringewithoutneedle.After threedays,the amount of active proteinwas measured. Statistical analysis showedthat the highestamount ofprotein was obtainedin theleavesof mamaei cultivar transformedby theexpression systemcausing accumulation ofproteins in theendoplasmic reticulum by LBA4404 strain. So forrapidproduction ofrecombinant protein in Almond, theagroinfiltration method by using the related expression system, LBA4404 strain and mamaei cultivar, isrecommended.Keywords: Transient expression, Agroinfiltration, Agrobacterium, Expression system, Almond}
-
به منظور تولید و خالص سازی پروتئین حرکتی ویروس موزائیک پیسک سبز خیار (Cucumber green mosaic mottle virus، CGMMV)، از یک حامل ویروس گیاهی که از همسانه ی آلوده کننده ویروس موزائیک زرد کدو به دست آمده است، استفاده شد. قاب خواندنی رمز کننده پروتئین حرکتی ویروس (CGMMV MP) میان قاب های P1 و HC-Pro در حامل ZYMV قرار داده شد. توانایی آلوده کنندگی حامل نوترکیب با مالیدن پلاسمید روی گیاه سلمه تره و بروز لکه های موضعی تایید شد. سپس یک لکه منفرد برای انتقال مکانیکی ویروس نوترکیب به کدو در مرحله دو برگی استفاده شد. پایداری بیان پروتئین نوترکیب با انتقال پی در پی ویروس نوترکیب از گیاهان مایه زنی شده به گیاه سالم و نیز در طول یک دوره ی 30 روزه پس از مایه زنی ارزیابی شد. برگ گیاهان مایه زنی شده به وسیله RT-PCR و آزمون وسترن بلات بررسی شد. پروتئین نوترکیب به روش رسوب در شیب غلظت سوکروز و سپس استخراج از ژل خالص سازی شد و از هر مرحله نمونه گیری به عمل آمد و با آزمون وسترن بلات و SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده نشان داد که دو هفته پس از مایه زنی 8/1 تا 2/2 گرم پروتئین نوترکیب از هر صد گرم برگ کدو قابل دستیابی است. همچنین حامل نوترکیب پس از 10 بار انتقال متوالی و پس از یک دوره 30 روزه پایدار بود. این پژوهش روشی سریع و آسان برای تولید فراوان پروتئین حرکتی ویروس موزائیک پیسک سبز خیار در گیاه ارایه می کند.
کلید واژگان: بیان موقت, پروتئین نوترکیب, ZYMV}To produce and purify movement protein of Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV MP), a plant viral vector engineered from an in vivo infectious clone of Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) was used. The CGMMV MP ORF was in frame inserted between the P1 and HC-Pro ORFs of the ZYMV vector. The infectious activity of the vector was approved by rubbing the plasmid on Chenopodium quinoa leaves and observing local lesions. Individual lesions were mechanically transferred to the systemic host plant zucchini squash at the stage of two-cotyledon. The stability of recombinant protein expression was assessed by successive passages of recombinant from infected plant and throughout the period of 30 days after inoculation in a single plant and after 10 serial passages. Then, the leaves tissues of inoculated plant were analyzed by RT-PCR and western blot analysis. Recombinant protein was purified using centrifuge method combine with gel extraction; each step was sampled and analyzed by western blotting and SDS-PAGE. The results showed approximately 1.8–2.2 mg recombinant MP per 100 g tissues were purified from leaves two weeks post inoculation. Also, the vector was remarkably stable in squash after 10 serial passages and 30 days. The procedure provides a convenient and fast method for production of large quantities of pure CGMMV MP in planta.Keywords: transient expression, recombinant protein, ZYMV} -
بیان موقت ژن ها اغلب به منظور ارزیابی بیان سازه ها و یا تست فعالیت یک پروتئین نوترکیب پیش از در نظر گرفتن اهداف بلند مدت برای گیاهان تراریخته به کار می رود. بیان موقت به واسطه اگروباکتریوم (اگرواینفیلتریشن) ابزاری با ارزش برای مطالعه بیان ژن خارجی، بررسی عملکرد سیستم های بیانی و راه اندازها و تولید پروتئین های با ارزش در گیاهان می باشد. با نفوذ سلول های اگروباکتریوم حامل سازه های ژن هدف به داخل برگ های سالم لوبیا که هنوز به گیاه مادر متصل هستند، بیان موقت طی سه روز و بدون نیاز به وسایل گران قیمت و یا روش های پیچیده انجام می شود و پروتئین مورد نظر را تولید می کند. در این مطالعه سه سیستم مختلف بیان ژن شامل ترکیباتی از عناصر مختلف تنظیم کننده بیان ژن از طریق تزریق سوسپانسیون اگروباکتریوم، حامل ترکیبات پلاسمیدی سیستم های مورد نظر، به داخل برگ های گیاه لوبیا انتقال داده شد. بعد از سه روز میزان پروتئین محلول در برگ اندازه گیری شده، آزمون مقایسه میانگین ها انجام شد. این تحقیق به منظور ارزیابی سیستم های بیانی پیشنهادی در گیاه لوبیا با استفاده از تکنیک اگرواینفیلتریشن برای انتخاب بهترین سیستم جهت انتقال ژن نوترکیب به گیاه لوبیا مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیشترین میزان تولید پروتئین از بین سه سیستم بیانی که سبب ترشح پروتئین در منطقه آپوپلاست، سیتوپلاسم و شبکه آندوپلاسمی می شوند مربوط به سیستمی است که سبب انتقال و تجمع پروتئین در شبکه آندوپلاسمی شده است. همچنین کارایی تراریختی با استفاده از این روش، 50-24 درصد محاسبه شد.
کلید واژگان: اگروباکتریوم, بیان موقت, ژن, سیستم تظاهر ژن, لوبیا}Journal of Genetics, Volume:8 Issue: 3, 2013, PP 273 -282Transient expression of genes using Agrobacterium (Agroinfiltration) is a powerful tool for the analysis of foreign gene expression and function in different gene expression systems in plant before stable plant transformation. However, the production of stable transgenic plants is a lengthy process, in transient assays, it is possible to measure gene expression within a very short time. With simple infiltration of Agrobacterium cells carrying appropriate gene constructs into bean intact leaves, transient expression can be performed within 3 days without using expensive instruments or complicated procedures. In this study, We analysed different regulatory gene expression factors affecting transient expression following agroinfiltration in bean by injection suspensions of the Agrobacterium carrying the plasmid constructs of gene interest. After three days the amount of soluble protein in the leaves was measured and compared. This study proposed to evaluate the best systems expression in transgenic bean plants, using agroinfiltration technique. The results demonstrate that between the three systems expression the highest level of protein is producted by the system that makes the transfer and accumulation of proteins in the endoplasmic reticulumin this study. The efficiency of agroinfiltration was 24-50%.Keywords: Agrobacterium, Bean, Gene expression system, Transient expression} -
بیان موقت ژن های بیگانه در بافت های گیاهی برای آنالیز عملکرد ژن در زمان کوتاه روش کارآمدی می باشد. این روش سریع، انعطاف پذیر، ساده و در بافت های تمایز یافته قابل اجرا است. پیشبر 2A11 از پیشبرهای ویژه بافت میوه گیاه گوجه فرنگی است که باعث بیان بالای ژن 2A11 در میوه می شود. هدف از این تحقیق همسانه سازی پیشبر 2A11 و بررسی بیان آن است. پس از استخراج DNA ژنومی از گیاه گوجه فرنگی، پیشبر 2A11 با استفاده از پرایمر اختصاصی تکثیر و در ناقل PTZ57R/T همسانه سازی شد. قطعه موردنظر با دو آنزیم برشی BamHI و HindIII جدا و جایگزین پیشبر دایمی CaMV35S در ناقل دوگانه pBI121 گردید. پلاسمیدهای نوترکیب به روش شوک حرارتی به Agrobacterium tumefaciens سویه LBA4404 منتقل شدند. با استفاده از روش اگرواینفیلتریشن بیان ژن GUS در بافت میوه گیاهان گوجه فرنگی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که در مقایسه با پیشبر CaMV35S، 2A11 نیز با کارایی بالایی باعث بیان ژن GUS در میوه گوجه فرنگی می شود. بنابراین، از این پیشبر می توان برای بیان پروتئین های نوترکیب در میوه گوجه فرنگی استفاده کرد.
کلید واژگان: اگرواینفیلتریشن, بیان موقت, پیشبر 2A11, ژن gus, همسانه سازی}Transient expression of foreign genes in plant tissues is a valuable tool for plant biotechnology and to shorten the time for gene functional analysis. Transient expression is a fast، flexible، simple and easy method that could be used in fully differentiated plant tissues. 2A11 promoter is a tomato fruit specific promoter whose expression occurs in fruit significantly. Cloning of fruit-specific promoter (2A11) is the main purpose of this study. 2A11 promoters were amplified from genomic DNA of tomato by PCR using specific primers. The promoter fragments were cloned into cloning vector PTZ57R/T. Recombinant plasmids were transferred into E. coli XLI-blue strain. Fragments of the interest were digested using restriction enzymes BamH1 and HindIII and were then purified and substituted in CaMV35S promoter in binary pBI121. Binary pBI121 was selected for cloning of 2A11 promoters as it is an ideal vector for agroinfiltration due to the presence of the CaMV35S promoter and the GUS reporter gene within its T-DNA region. Recombinant plasmids were transformed into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain with freeze and thawing method. The expression of GUS gene was analyzed in tomato with agroinfiltration method. The results showed that، 2A11 promoter was found as efficient as CaMV35S promoter in expression of GUS gene specifically in tomato fruit. Then، we can use this promoter for tissue specific expression of recombinant proteins in tomato fruits.Keywords: 2A11, Agroinfiltration, Promoter, Tomato, Transient expression}
نکته
- نتایج بر اساس تاریخ انتشار مرتب شده‌اند.
- کلیدواژه مورد نظر شما تنها در فیلد کلیدواژگان مقالات جستجو شده‌است. به منظور حذف نتایج غیر مرتبط، جستجو تنها در مقالات مجلاتی انجام شده که با مجله ماخذ هم موضوع هستند.
- در صورتی که می‌خواهید جستجو را در همه موضوعات و با شرایط دیگر تکرار کنید به صفحه جستجوی پیشرفته مجلات مراجعه کنید.
©2000-2024 magiran.com All Rights Reserved.