جداسازی و کلونینگ ژن پروتئین سطحی (psp) استرپتوکوک پنومونیه در باکتری اشریشیاکلی DH5 آلفا جهت دستیابی به واکسن

استرپتوکوک پنومونیه یا پنوموکوک، دیپلوکوک گرم مثبت به قطر 5/0 تا 2/1 میکرومتر، آلفا همولیتیک و تحمل کننده اکسیژن از جنس استرپتوکوکوس و عامل بیماریهایی چون مننژیت و ذات الریه می باشد.باکتری حامل ژن پروتئین سطحی Pneumococcal  A (PspC)از S بوده و هدفی امیدوارکننده برای فرمولاسیون های واکسن جدید است. به همین جهت هدف از انجام این تحقیق جداسازی و کلونینگ ژن پروتئین سطحی (psp) استرپتوکوک پنومونیه در باکتری اشرشیاکلی DH5 آلفا به منظور تهیه واکسن برای کودکان می باشد.

 نمونه ها از تعداد 100 کودک سالم، در مهد کودک های شهر اراک به طور تصادفی از نازوفارنژیال کودکان سالم زیر 6 سال  بود که در مجموع 12 ایزوله پنوموکوک جداسازی شد. به منظور جداسازی و شناسایی اولیه استرپتوکوک پنومونیه از محیط کشت و آزمون های بیوشیمیایی استفاده شد و استخراج DNA صورت گرفت. از طریق آزمون PCR سویه های واجد ژن pspC شناسایی شد. ژن pspC سویه های مثبت از طریق وکتور به باکتری میزبان اشرشیاکلی الحاق و از طریق تکنیک TA کلونینگ کلون شدند و در پایان از طریق تکنیک Real time PCR میزان بیان ژن ها در اشرشیا کلی DH5 آلفا سنجیده و برای رسم درخت فیلوژنی از نرم افزار clustalX و Mega5 استفاده شد.

از غربالگری نمونه های بالینی ارسالی به آزمایشگاه که براساس خصوصیات مورفولوژیک، میکروسکوپی و تست های بیوشیمیایی تعیین هویت شدند در مجموع 12 ایزوله پنوموکوک جداسازی شد. و از این تعداد 1 ایزوله دارای ژن  pspC بود. پس از کلونینگ، ژن های  pspC، سویه های کلون شده کلنی سلکشن (آبی/سفید) جداسازی شدند. به منظور تایید نتایج کلونینگ DNA , از کلنی های مشکوک استخراج و توسط آزمون Real time PCR گردید. در نهایت  تصاویر سکانسینگ ، m13 و منحنی تکثیر،  بیان ژن در باکتری اشریشیاکلی DH5α را تایید کرد.

در این مطالعه با ارزیابی ژنومی پنوموکوک جدا شده از کودکان زیر 6 سال ،  ژن pspC با پتانسیل ایمن سازی و به منظور ساخت واکسن از این باکتری استخراج گردید  و کلونینگ با موفقیت صورت گرفت. در نهایت با بررسی درخت فیلوژنی رسم شده در این مطالعه میزان تشابه و خویشاوندی گونه استرپتوکوک پنومونیه با سایر گونه ها نشان داده شد.