جداسازی پلاسماسل از خون محیطی و هم کشتی با سلول استرومای مغز استخوان به منظور کشت طولانی مدت

فن آوری تهیه ی آنتی بادی بر پایه ی تک سلول B روشی نوین در تهیه ی آنتی بادی مونوکلونال انسانی محسوب می گردد. مهم ترین بخش این فن آوری، کشت طولانی مدت پلاسماسل جدا شده از خون جهت ترشح آنتی بادی است. با توجه به این که دلیل زنده ماندن طولانی مدت پلاسماسل ها در مغز استخوان حضور سیگنال های اطراف آن ها است، جهت کشت پلاسماسل درشرایط In vitro لازم است این سیگنال ها به واسطه ی حضور یک لایه سلول تغذیه کننده تامین شوند. به نظر می رسد که از میان انواع مختلف این سلول ها، سلول های استرومای مغز استخوان (BMSCs یا Bone marrow stromal cells) گزینه ی مناسب تری جهت هم کشتی با پلاسماسل محسوب می گردند. هدف از این پژوهش، جداسازی پلاسماسل های ترشح کننده ی آنتی بادی از خون محیطی و زنده نگهداشتن آن ها در شرایط In vitro می باشد.
پس از تزریق واکسن کزاز، تیتر آنتی بادی در سرم خون افراد داوطلب با روش الایزا اندازه گیری شد. PBMCs (Peripheral blood mononuclear cells) جدا شده از خون فرد ایمن با آنتی بادی های رنگی اختصاصی سه نشانگر سطحی 45CD، 19CD و 38CD رنگ آمیزی شدند. پس از آن پلاسماسل ها به روش FACS (Fluorescence-activated cell sorting) از سایر جمعیت های سلولی موجود، جدا و در پلیت 96 خانه ای Sort شدند. سپس همراه با یک لایه BMSCs کشت داده شدند. پس از گذشت 10 روز، از پلاسماسل ها RNA استخراج شد و واکنش RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن آنتی بادی انجام شد.
روز ششم پس از واکسیناسیون، تیتر آنتی بادی سرم، IU/ml 16 به دست آمد که نشان از پاسخ ایمنی بسیار مناسب در مقابل واکسن کزاز بود. همچنین، آنالیز فلوسایتومتری نمونه ی خون محیطی فرد ایمن شده در روز هفتم، درصد پلاسماسل موجود در PBMCs را حدود 3/0 درصد نشان داد. در نتیجه ی انجام واکنش RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن آنتی بادی، قطعه VH (Variable heavy chain) به طول bp 400 تکثیر شد. این نتیجه، زنده بودن پلاسماسل ها و همچنین بیان ژن آنتی بادی را در روز دهم در شرایط هم کشتی با BMSCs تایید نمود.
حاصل این پژوهش، فراهم آوردن شرایط مناسب به منظور کشت پلاسماسل برای مدت 10 روز در محیط In vitro بود. بنابراین بخشی از فن آوری نوین تهیه ی آنتی بادی بر پایه ی تک سلول B نیز پایه گذاری شد. نتایج به دست آمده در این پژوهش شامل درصد پلاسماسل موجود در PBMCs و اندازه ی قطعه ی ژنی VH تکثیر شده، با سایر مطالعات انجام شده در این زمینه مطابقت داشت.