کلونینگ و بیان خارج سلولی آنزیم لاکاز از باکتری باسیلوس بومی چشمه های آب گرم ایران درمخمر Pichia pastoris

لاکازها (EC 1.10.3.2) توانایی اکسیداسیون دامنه وسیعی از سوبستراهای فنولی و غیر فنولی را دارند. میزبان مخمری با توجه به مزیت هایی که در قدرت راه انداز، کارایی ترشح، رشد سریع و آسان و عدم سمیت غذایی نسبت به سایر میزبان های سلولی دارند، به طور قابل توجهی در تولید مورد استفاده قرار می گیرند. در این تحقیق ژن کد کننده آنزیم لاکاز که از باکتری باسیلوس سویه HR30 جداسازی شده بود با ترجیح کدونی برای مخمرPichia pastoris سنتز شده و سپس در پلاسمید بیانی مخصوص مخمر پیکیا پاستوریس کلون شده و از طریق روش الکتروپوریشن به داخل مخمر انتقال یافت. برای تائید کلونینگ از روش کلونی PCR و هضم آنزیمی استفاده شد و قطعه 1542 جفت بازی مشاهده شد. سپس ژن مورد نظر تحت شرایط دمایی و غلظت های متفاوت از سولفات مس بیان شد. نتایج نشان داد که میزان تولید پروتئین در غلظت های یک، یک و نیم و دو میلی مولار از سولفات مس (به عنوان کوفاکتور برای آنزیم) و درجه حرارت های 20، 25 و 30 درجه سانتی گراد محیط کشت متغیر بود. کاهش دمای محیط کشت تا مرز 20 درجه سانتی گراد و غلظت دو میلی مولار ازسولفات مس توانست باعث بهبود فرایند تاخوردگی مجدد و فعالیت آنزیم لاکاز شود.