بررسی فتوتیپ و عمل لنفوسیت های T در افراد 30-10 ساله و ارتباط تغییرات آن با سن

همزمان با سالخوردگی بدن، سیستم ایمنی نیز دچار پیری می گردد. کاهش تدریجی پاسخ دهی به آنتی ژن ها و پیری لنفوسیت های T در اثر پیری سیستم ایمنی مشاهده می شود. این پدیده به عنوان یک مشکل در بازسازی زیر جمعیت های لنفوسیت ها و عملکرد
آن ها در نظر گرفته می شود. از این رو تغییرات فتوتیپی لنفوسیت ها و تغییرات سیتوکین ها با پیری ایمنی همراه می گردد واز اهمیت پیش آگهی برخوردار است (1). پیری ایمنی می تواند به صورت زودرس در افراد جوان به علت التهابات مزمن، عفونت ها و شرایط نئوپلاستیک رخ دهد (2). ویژگی مشخص پیری ایمنی تجمع لنفوسیت های با فتوتیپ خاطره ای تمایز یافته یا خاطره ای اجرایی با فتوتیپ های CD28-CD27- یا CD28+CD27- و کاهش تعداد لنفوسیت های T بکر با فتوتیپ CD27+CD28+ است (5-3). تعداد لنفوسیت های بکر در هر دو گروه CD4 و CD8 با افزایش سن به طور پیش رونده کاهش نشان داده است و این نقصان در سن 90-70 سالگی در لنفوسیت های CD4 به میزان 4 برابر و در لنفوسیت های CD8 به میزان 3-2 برابر نسبت به سنین جوانی بوده است (6). در سنین پیری لنفوسیت های بکر CD95- با سلول هایCD28- جایگزین می گردد. علاوه بر این افزایش جمعیت لنفوسیت هایT مثبت از نظر سیتوکین های تیپI (IL2، IFNγ، TNFα) دیده می شود (7). لنفوسیت های CD4+CD27-CD28- در تحریک با آنتروتوکسین B استافیلوکوک تکثیر کمتری نسبت به لنفوسیت های CD4+CD28+CD27+ دارند (8). افزایش جمعیت لنفوسیت های CD4+CD57+ نیز در کهنسالی گزارش شده است (7،9،10). افزایش بیان این گلیکو پروتئین به عنوان علامتی از حساسیت به اپوپتوز شناخته می شود (11). لنفوسیت های CD3+CD57+ نسبت به اپوپتوز القاء شده بر اثر تحریک سلول حساس تر از لنفوسیت های CD3+CD57- هستند (12). مولکول CCR7 نیز به عنوان شاخصی از جداسازی لنفوسیت های بکر از خاطره ای اجرایی شناخته می شود (7،13). تعیین تولید سایتوکین یک نشانگر با ارزش در مطالعه پاسخ ایمنی نسبت به محرک های ایمنولوژیک است. سایتوکین ها درگیر در تنظیم سیستم ایمنی هستند. لنفوسیت های T خاطره ای CD4، پاسخ های ایمنی در برابر پاتوژن ها را اساسا از طریق ترشح سایتوکین هدایت می کنند. الگوی تولید سایتوکین می تواند در تشخیص عمل طبیعی یا غیر طبیعی سلول های T استفاده شود و اطلاعاتی در خصوص پاسخ به پاتوژن فراهم می کند (14،15) و نیز تغییرات وابسته به سن در آن ها دیده می شود (16). Zanni و همکاران نشان داده اند که افزایش داخل سلولی سایتوکین های تیپ 1 در لنفوسیت های CD8+ وابسته به سن است، اما افزایش سایتوکین های تیپ 2 تنها در زیر گروه خاطره ای دیده می شود (15). در مطالعه ای که تولید داخل سلولی IL2 و اینترفرون گاما را در افراد سالخورده و جوان CMV+ مقایسه نموده است، افزایش محسوس لنفوسیت های CD4+
تولید کننده اینترفرون گاما در پاسخ به انتروتوکسین B استافیلوکوک در افراد سالخورده دیده شده است (17). سوالی که مطرح می گردد، این است که آیا پیشرفت به سمت تغییرات مناسب با پیری ایمنی در فتوتیپ و عملکرد لنفوسیت های T تدریجی است و از سنین پایین شروع می گردد یا در جوانی این تغییرات نامحسوس است و در سنین پیری به سرعت اتفاق می افتد؟ در مطالعه حاضر تغییرات فتوتیپی مرتبط با پیری ایمنی در لنفوسیت های T در یک گروه سنی از افراد سالم
30-10 ساله تعیین و همبستگی آن با سن بررسی شده است. علاوه بر این IL2 و IFNγ از سایتوکین های تیپ 1 نیز مورد بررسی قرار گرفته است.
این مطالعه ی توصیفی به صورت مقطعی، بر روی نمونه 26 فرد سالم در گستره سنی 30-10 با میانگین 75/4±66/19 سال انجام شد. از افراد مورد مطالعه پس از گرفتن رضایت نامه ی آگاهانه، 5 سی سی نمونه ی خون وریدی گرفته شد که در دو لوله ی جداگانه یکی هپارینه و دیگری دارای ضد انعقاد EDTA ریخته شد. برای اندازه گیری شاخص های هماتولوژیک، پس از جمع آوری نمونه ها در لوله ی حاوی ضد انعقاد EDTA شمارش خونی با شمارشگر سلولیSysmex 800 سنجش شد.
تعیین داخل سلولی سیتوکین ها با استفاده از متد تعریف شده قبلی انجام شد (18). نمونه خون حاوی EDTA قبل از استفاده در دمای اتاق نگهداری و در طی 8 ساعت پس از جمع آوری استفاده شد. در یک لوله پروپیلن 15 میلی لیتری 5/0 میلی لیتر خون کامل هپارینه، 5 میکرولیتر SEB (غلظت نهایی 1 میکرو لیتر/ میلی لیتر) و 5 میکرو لیتر آنتی بادی منوکلونال CD28 Anti- اضافه گردید. در لوله دوم 15 میلی لیتری نیز خون کامل هپارینه و آنتی بادی مونوکلونال CD28 Anti- (غلظت نهایی 1 میکروگرم/ میلی لیتر) اضافه گردید. هر دو لوله به آرامی مخلوط و سپس 2 ساعت در انکوباتور 37 درجه حاوی CO25%، انکوبه شد. (BFA) Berefeldin A به هر دو لوله اضافه و به آرامی مخلوط گردید و 4 ساعت دیگر انکوبه شد.
50 میکرو لیتر محلول EDTA به هر لوله اضافه و به شدت تکان داده شد، سپس 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سپس مجددا 10 ثانیه به شدت تکان داده شدند. 5 میلی لیتر از محلول لیز کننده به هر لوله افزوده و به آرامی تکان داده شد تا به خوبی مخلوط گردید، در ادامه 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سپس با نیروی g 500 به مدت 7-5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفوژ گردید. پس از شستشو و تخلیه مایع رویی، محلول نفوذ پذیر کننده به هر لوله افزوده و به آرامی تکان داده شد تا به خوبی مخلوط گردید، سپس 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سپس سانتریفوژ گردید. پس ازشستشوی مجدد 10 میکرو لیتر از آنتی بادی اختصاصی سایتوکاین به لوله ها افزوده شد (Anti-CD3 برای تعیین جمعیت لنفوسیت های T، Anti-CD4 برای تعیین جمعیت لنفوسیت های T کمکی و Anti-CD8برای تعیین جمعیت لنفوسیت های T سایتوتوکسیک وAnti-IL2 و Anti-IFNγ برای سنجش سایتوکاین استفاده شدند). همه لوله ها 30 دقیقه در تاریکی در دمای اتاق انکوبه و در نهایت شستسو شدند.
برای بررسی بیومارکرهایCD28، CD27، CD57 و CCR7 نمونه ی خون در لوله ی حاوی ضد انعقاد سدیم هپارین، جمع آوری شده و با استفاده از بافر آمونیوم کلراید، RBCs باقی مانده در طول مراحل
آماده سازی سلول های تک هسته ای، لیز گردید. جهت رنگ آمیزی، سلول ها با آنتی بادی مونوکلونال کونژوگه مجاور و سپس در دمای 4 درجه و در تاریکی، انکوبه شده و پس از اتمام زمان انکوباسیون، سلول ها را شسته و در پارافرمالدئید، فیکس و تا زمان آنالیز فلوسایتومتریک، در دمای 4 درجه و در تاریکی، نگهداری کردیم.
سلول ها بر اساس مارکر مورد نظر، شمارش شدند؛ در انتها داده های فلوسایتو متریک با نرم افزار Flowmax، آنالیز گردیده و سپس با توجه به شمارش سلولی انجام شده ی قبلی، تعیین تعداد مطلق انجام شد.
آنتی بادی های مورد استفاده شاملAnti-CD4، Anti-CD8، Anti-CD3، Anti-CD57، Anti-CD27، Anti-CD28، Anti-CCR7، Anti-Il2، Anti-IFNγ از شرکت Becton-Dickinson خریداری گردید. SEB و BFA از سیگما و محلول های لیز کننده و نفوذ پذیر کننده نیز از Becton-Dickinson تهیه شد.
داده های محاسبه شده بر اساس شمارش کامل خونی و یافته های فلوسایتومتری و سایر تست های آزمایشگاهی با نرم افزار SPSS و با روش های آماری توصیفی و آزمون همبستگی اسپیرمن تجزیه و تحلیل شد.
افراد مورد مطالعه شامل یک گروه 26 نفره از افراد سالم با میانگین سنی 66/19 شامل 7/57% مرد بودند. میانگین سنی مردان و زنان تفاوت آماری نداشت. میانگین تعداد گلبول قرمز 106×64/0±07/5 و هموگلوبین آن ها 20/1±79/13 گرم در صد میلی لیتر بود.
شمارش گلبول های سفید ((WBC در افراد مورد مطالعه 89/818±13/5134 در میلی متر مکعب بود که از این تعداد 12±8/43% آن لنفوسیت بود. در گستره خون محیطی افراد مورد مطالعه تغییر
غیر طبیعی در لوکوسیت ها مشاهده نشد. نسبت لنفوسیت های CD3+ و نیز میزان هر یک از زیر گروه های CD4 و CD8 در جدول شماره 1 دیده می شود.
میزان لنفوسیت های T مثبت از نظر هر یک از شاخص های فنوتیپی و نیز لنفوسیت های T تولید کننده IL2 و IFNγ مورد بررسی قرار گرفت (جدول شماره 2). میزان لنفوسیت های CD4 مثبت از نظر هر یک از مارکرهای فنوتیپی CD27، CD28، CD57، CCR7 و نسبت سلول های تولید کننده IL2 و IFNγ بیش از میزان آن ها در زیر گروهCD8 بود.
همبستگی میزان سلول های بیان کننده هر یک از شاخص های فنوتیپی با سن، تعداد لنفوسیت T و زیر گروه های CD4 و CD8 بررسی گردید که نتایج آن در جدول شماره 3 دیده می شود. همانگونه که در جدول مشاهده می شود از بین شاخص های مورد مطالعه، تنها میزان سلول های CCR7+CD8+ با سن رابطه معکوس معنی دار داشت و سایر شاخص ها با سن رابطه ای نداشت. تعداد لنفوسیت های T بیان کننده شاخص های مورد بررسی به جز CCR7 و CD57 در زیر گروه CD8 با تعداد لنفوسیت T و تعداد لنفوسیت CD4T ارتباط معنی دار داشت. تعداد لنفوسیت های T بیان کننده شاخص های CD27، CD28، CD57 با تعداد لنفوسیت CD8 رابطه معنی دار داشت. میزان سلول های
بیان کننده هیچ یک از شاخص های مورد بررسی با نسبت سلول های تولید کننده IL-2 و IFNγ ارتباط معنی دار نداشت (نتایج در جدول آورده نشده است)؛ همچنین بین نسبت سلول های تولیدکننده IL-2 و IFNγ با سن ارتباط معنی دار مشاهده نگردید.
بین نسبت لنفوسیت های CD4 و CD8 بیان کننده IL2 و نیز نسبت لنفوسیت های CD4 و CD8
بیان کنندهIFNγ همبستگی معنی دار وجود داشت.
بحث:نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در افراد مورد مطالعه نسبت لنفوسیت های CD3 بیش از 50% و نسبت CD4 به CD8، 54/1 است. این نتایج همسو با سایر یافته های قبلی است که CD3+ با گذشت سن کاهش می یابد و نیز در افراد جوان سالم نسبت CD4 به CD8 بیش از 1 است و در سنین پیری این نسبت کاهش یافته و ممکن است معکوس گردد (6). در بررسی فتوتیپ لنفوسیت های CD4 و CD8 میزان لنفوسیت های بیان کننده هر یک از شاخص های فتوتیپی CD27، CD28، CD57، CCR7 در زیر گروه CD4 بیش از CD8 بود که با توجه به نسبت CD4 به CD8 این یافته قابل انتظار است. شواهد نشان می دهد که لنفوسیت های CD8+CD28- نقش مهمی در بیماری هایی که همراه با فعال شدن مزمن سیستم ایمنی است و نیز با تغییرات مرتبط با سن در سیستم ایمنی دارد و تغییرات فنوتیپی مرتبط با پیری نقش مهمی در بیماری های مرتبط با سیستم ایمنی دارد (19،12). افزایش لنفوسیت های CD4+CD28- (CD4+CD57+) نیز در تحریکات مزمن سیستم ایمنی مشاهده شده است (12). بر اساس نقطه نظر AKbar و همکاران، لنفوسیت های T کاملا تمایز یافته در هر دو زیر گروه CD4 و CD8 مولکول های CD28 و CD27 را از دست می دهند، اما سلول های CD8 ابتدا CD28 و سپس CD27 را از دست می دهند و در سلول های CD4 این مسیر بر عکس است (20). تحریک مزمن آنتی ژنیک منجر به تجمع تدریجی سلول های T الیگوکلونال اختصاصی آنتی ژن که در مراحل نهایی تمایز هستند،
به ویژه در زیر گروه CD8 می گردد. این سلول ها با کوتاه شدن طول تلومر، از دست دادن CD28 یا بیان CD57 مشخص می گردند و افزایش سلول های CD3+CD57+ از اهمیت بالینی برخوردار است (21،12). بر اساس مطالعه Kovaiou و همکاران، افراد پیر درصد پایین تری از لنفوسیت های CD4+CD28+CD27+، اما درصد بالاتری از سلول های CD4+CD28+CD27- و CD4+CD28-CD27- دارند. گروه اخیر در همه افراد پیر به نسبت های مختلف وجود دارد، در حالی که این زیر گروه در افراد جوان تنها در افراد کمی دیده می شود (8). به نظر می رسد لنفوسیت های خاطره ای اجرایی در هنگام برخورد با آنتی ژن مولکول های CD27 خود را از دست داده اند (22). سلول های با مقادیر زیاد CD27 در بین لنفوسیت ها ی اختصاصی ویروس یافت نشده است که نشان می دهد در زمان مواجهه با آنتی ژن آن را از دست داده اند (23). هر دو زیر گروه سلول های خاطره ای -CD27 هستند (24). با توجه به اینکه گروه مورد مطالعه ما افراد سالم بودند، ما همبستگی بین میزان هر یک از زیر گروه های لنفوسیتی بیان کننده شاخص های فوق را با سن بررسی نمودیم و همانگونه که در جدول شماره 3 مشاهده می گردد بین فراوانی لنفوسیت های CD4 و CD8 بیان کننده 3 شاخص فوق با سن در هیچ مورد همبستگی وجود نداشت، اما بین این فراوانی و تعداد کل لنفوسیت ها ارتباط معنی دار مشاهده گردید که قابل انتظار است. ظاهرا در گروه سنی مورد مطالعه ما تاثیر تغییرات سن بر تغییر زیر گروه های لنفوسیت T بیان کننده شاخص های فتوتیپی محسوس نبوده است که بتواند همبستگی معنی دار نشان دهد. با توجه به اینکه تفداد افراد مورد مطالعه ما محدود بوده است، ممکن است نیاز به بررسی بیشتر جهت یافتن نتایج جامع تری از ارتباط بین تغییرات این زیر گروه ها و سن باشد.
در بررسی همبستگی بین فراوانی لنفوسیت های T بیان کننده فتوتیپ CCR7 و سن، همبستگی منفی معنی دار در لنفوسیت های CD8 مشاهده گردید (جدول شماره 3). CCR7 یکی از شاخص های است که در تشخیص لنفوسیت های بکر و اجرایی استفاده می شود. بر اساس یک تعریف لنفوسیت های بکر یا خاطره ای مرکزی CCR7+ و لنفوسیت های خاطره ای اجرایی CCR7- هستند که با توجه به بیان CD27 خود این گروه نیز به دو دسته تقسیم می گردند (11،25). لنفوسیت های CD4+ تعداد و تغییرات خود به سمت لنفوسیت های خاطره ای اجرایی CD45-CCR7- را تا مدت زیادی به تعویق می اندازند و تغییرات محسوس در دهه 70 اتفاق می افتد (26). این موضوع می تواند عدم همبستگی بین فراوانی لنفوسیت های CD4+CCR7+ و سن را در مطالعه ما توضیح دهد. در بیماران آلوده شده با HIV، بیماران با تعداد بیشتری ویروس، دارای فراوانی بیشتری از لنفوسیت های CCR7- بوده اند که تایید کننده کاهش لنفوسیت های بکر و خاطره ای مرکزی است (7).
تغییرات میزان سایتوکین ها نیز به عنوان یکی از تغییرات همراه با افزایش سن مورد توجه قرار گرفته است. در مطالعه Zanni و همکاران در افراد مسن، افزایش داخل سلولی سایتوکین های تیپ 1 و 2 در همه زیر گروه های لنفوسیت های CD8 دیده شده است، در حالی که افزایش قابل توجه نوع 1 همراه با افزایش سن تنها در لنفوسیت های خاطره ای دیده شده است. در این مطالعه گروه های سنی مورد مطالعه تا سنین پیری گسترش داشته است (15). در مطالعه ما نسبت لنفوسیت های تولید کننده IL2 در زیر گروه CD4 بیش از 2 برابر فراوانی لنفوسیت های بیان کننده IFNγ بود. این موضوع می تواند با این یافته که لنفوسیت های بکر و خاطره ای مرکزی بیش از لنفوسیت های اجرایی از نظر IL2 مثبت هستند، توجیه شود و با توجه به جوان بودن گروه مورد مطالعه می تواند، توضیح داده شود (7). در مطالعه ای که توسط Kleiner و همکاران صورت گرفته تفاوت میزان سایتوکین های بین کودکان و نوجوانان با بالغین بیش از 18 سال بررسی و مشخص شده است که بعضی از آن ها در بالغین کاهش و بعضی افزایش دارد (27). در مطالعه Alvarez-Rodriguez و همکاران افزایش سن همراه با افزایش IL12، IL13، IL16 و TNFα بوده است (16). در مطالعه ما ارتباط معنی داری بین میزان سلول های تولید کننده IL2 و IFNγ با سن یافت نشد که احتمالا دلیل آن می تواند نزدیکی سن افراد مورد مطالعه به یکدیگر باشد. وجود همبستگی بین نسبت لنفوسیت های CD4 و CD8 تولید کننده IL2 با IFNγ در افراد مورد مطالعه بیانگر تغییرات موازی این در زیر مجموعه دو این گروه سنی با یکدیگر می باشد.
با توجه به عدم وجود همبستگی معنی دار بین میزان لنفوسیت های T بیان کننده هر یک از شاخص های فتوتیپی مورد مطالعه با سن در افراد سالم، احتمالا بروز تغییرات محسوس پیری ایمنی منحصر به سنین پیری است و تغییرات تدریجی جزئی در سنین جوانی در حدی نیست که به صورت معنی دار بروز کند. میزان لنفوسیت های تولید کننده IL2 و IFNγ نیز ظاهرا به همین صورت با سن ارتباط معنی دار نداشت. جهت تکمیل داده های فوق پیشنهاد می گردد، گروه های سنی دیگر نیز مورد بررسی قرار گیرند.