ساخت سازه پلاسمیدی بیان کننده ژن mda-7 تغییر یافته به وسیله توالی iNGR و ارزیابی آن برای القای مرگ سلولی برنامه ریزی شده در رده سلول سرطانی کبد

ژن mda-7/IL-24 یک ژن سرکوب گر تومور است. پپتید iNGR با گرایش به اینتگرین های سطح سلول سرطانی در هدفمندسازی عوامل درمانی علیه سلول های توموری به کار گرفته شده است. هدف این مطالعه ساخت ژن mda-7/IL-24 متصل به پپتید iNGR و مقایسه فعالیت آن با ژن طبیعی است.
مواد و روش‏ها: در ابتدا، mda-7 با استفاده از روش PCR تکثیر یافت. آغازگر برگشت حاوی توالی پپتید iNGR بود تا این توالی در انتهای ژن mda-7 ایجاد شود. توالی ژن تغییر یافته mda7/iNGR و mda7 (کنترل) در ناقل بیانی یوکاریوتی pCDNA3.1 دودمان سازی شدند. با استفاده از روش های هضم آنزیمی، colony-PCR و توالی یابی درستی دودمان سازی، یکپارچگی ناقل ها و توالی آن ها ارزیابی شد. با استفاده از لیپوفکتامین سازه ها در سلول های Ad-293 ترانسفکت و توانایی آن ها برای بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از آزمایش الایزا ارزیابی شد. در ادامه، این سازه ها به سلول های HepG2 ترانسفکت و بعد از استخراج mRNA با استفاده از روش Real time PCR بیان ژن های پیش آپوپتوزی Gadd153 و Bax اندازه گیری شد. با رنگ آمیزی Anexin/PI و فلوسیتومتری میزان مرگ برنامه ریزی شده در سلول HepG2 ارزیابی شد.
نتایج، درستی و یکپارچگی سازه ها را نشان داد. بیان مناسب و ترشح محصول mda-7. iNGR با کنترل آن یعنیmda-7 در سوپ رویی قابل مقایسه بود. نتایج زنده مانی نشان گر عدم مفید بودن این تغییر بر پروتئین mda-7 بوده است. بررسی مرگ سلولی برنامه ریزی شده با سنجش بیان ژن و فلوسیتومتری نیز نشان داد که اتصال iNGR به mda-7 بر خاصیت مرگ زایی آن تاثیر کاهنده داشته ولی در مقایسه با گروه کنترل منفی همچنان مرگ زایی معنی‏داری دارد (01/0>P).
ناقل بیانی pCDNA/Mda-7.iNGR پروتئین mda-7 متصل به iNGR را به طور مناسب بیان کرد ولی بر خاصیت مرگ زایی طبیعی پروتئین تاثیر بهینه ای نداشت.